Estudio de la regulación intracelular y extracelular de la actividad antibiótica de la microcina E492 por enterobactina y sus productos de hidrólisis

Abstract

Klebsiella pneumoniae RYC492 produce la microcina E492, un péptido con actividad bactericida que forma canales iónicos en la membrana interna de cepas de E. coli, Salmonella, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y algunas cepas de Vibrio. Su mecanismo de acción involucra un reconocimiento a nivel de la membrana externa, translocación hacia el espacio periplasmático y una interacción con el sistema TonB para insertarse en la membrana interna y formar un canal. Las bacteriocinas son importadas por receptores específicos de membrana externa necesarios para la captura de nutrientes como el hierro o la vitamina B12. Varios sistemas de receptores de membrana externa están asociados al sistema TonB, compuesto por las proteína ExbB, ExbD y TonB, que se localizan en la membrana citoplasmática y se extienden hacia el periplasma. Mutantes en exbB o tonB son resistentes a la acción bactericida de la microcina E492. Hasta ahora no había sido posible encontrar mutantes en receptores de membrana externa que sean resistentes a la microcina E492. Esto sugería que podría existir más de un receptor para la microcina E492. Para estudiar esta posibilidad, se buscó receptores que estuvieran asociados al sistema TonB/ExbBD. Se estudió la sensibilidad de mutantes únicas, dobles y triples para los receptores FepA, Fiu y Cir, que participan en la importación del sideróforo enterobactina y sus precursores. Los resultados de este trabajo demuestran que una сеpа mutante simultáneamente en estos tres receptores es resistente a la microcina E492. Otros componentes de la importación de enterobactina como la proteina periplasmática FepB o el sistema importador de membrana interna FepCDG, no son necesarios para la importación de microcina, puesto que cepas de E. coli mutantes en fepB o fepC son sensibles a esta bacteriocina. Por otra parte se observó que en la medida que se estimulaba la expresión de los receptores FepA, Fiu y Cir, la sensibilidad por la microcina aumentaba sugiriendo que la densidad de estos receptores en la membrana externa es una limitante para el grado de la potencia bactericida de la microcina E492. Se observó además que el receptor FepA es el transportador más eficiente; Fiu contribuye en forma moderada y Cir, participa cuando la concentración de microcina es mayor a 5 µM. La actividad de la microcina E492 no fue inhibida por un péptido sintético correspondiente a sus últimos 20 aminoácidos ni por anticuerpos dirigidos contra esta región de la microcina E492, lo cual sugiere que el reconocimiento es complejo y no involucra solamente una región de la proteína. Se estudió la capacidad de la enterobactina, sus productos de hidrólisis y el precursor DHB para actuar como antagonistas de la microcina E492. Los ensayos de inhibición indican que los principales antagonistas son el trímero lineal, la enterobactina y el dímero, siendo el monómero y el DHB antagonistas parciales cuando su concentración es muy alta. Además, ensayos de competencia entre los antagonistas y la microcina, utilizando como cepas indicadoras a mutantes que expresan algunos de los receptores FepA, Fiu y Cir, sugieren un mecanismo de inhibición de tipo maduración, esta forma es susceptible de ser activada. Se discutieron algunas hipótesis que pueden explicar este resultado, relacionando la maduración de la microcina E492 con la síntesis de moléculas relacionadas a la enterobactina. competitivo. La proteína MceD codificada en el sistema de la microcina estaría relacionada con el metabolismo de la enterobactina, pues posee un 30% de identidad con la enzima Fes de E. coli, una enterobactina esterasa que hidroliza la enterobactina para liberar el hierro a nivel intracelular. Es probable que en el citoplasma exista alguna asociación no covalente entre los productos de hidrólisis de un derivado de la enterobactina y la microcina E492, lo cual podría dificultar su liberación al espacio extracelular. La proteína MceD podría romper o modificar estas asociaciones permitiendo la secreción de la microcina E492. Estas suposiciones se basan en el que a partir del sobrenandante del cultivo de la cepa mutante mceD::Tn5 la microcina purificada no es detectada en geles de poliacrilamida. Al expresar esta mutante mceD en cepas que no sintetizan ni importan enterobactina se observa en geles de poliacrilamida una banda de microcina E492 igual que la banda de la microcina silvestre, lo cual sugiere que MceD es dispensable en ausencia de enterobactina o sus productos de hidrólisis. Por otro lado, si se expresa microcina silvestre en una cepa de E. coli H1885 (entDF) defectuosa en la síntesis de enterobactina, se produce microcina inactiva. Se analizó la estructura de esta forma inactiva por dicroismo circular y se encontró que poseía mayor porcentaje de estructura α-hélice a diferencia de la microcina activa que presenta un mayor contenido de estructura β. Este comportamiento es similar al observado en mutantes en la maduración de la microcina, que también producen una forma inactiva con mayor contenido en α-hélice. Al igual que la microcina purificada a partir de una mutante en la maduración, esta forma es susceptible de ser activada. Se discutieron algunas hipótesis que pueden explicar este resultado, relacionando la maduración de la microcina E492 con la síntesis de moléculas relacionadas a la enterobactina.

Klebsiella pneumoniae RYC492 produces microcin E492, a peptide with bactericidal activity that forms ion channels in the inner membrane of strains of E. coli, Salmonella, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter and some strains of Vibrio. Its mechanism of action involves a recognition in the outer membrane, translocation towards the periplasmic space and an interaction with the TonB system to be inserted in the citoplasmatic membrane to form a channel. The bacteriocins are imported by specific outer membrane receptors necessary for the uptake of nutrients such as iron or vitamin B12. Several systems of outer membrane receptors are associate to the TonB system, which is composed by proteins ExbB, ExbD and TonB, located in the cytoplasmic membrane and extend towards the periplasm. Single mutants in exbB or tonB are resistant to baçtericidal action of the microcin E492. Until now, no mutants in outer membrane receptors resistant to microcin E492 had been found. This suggests that more than one receptor to microcin E492 could exist. To study this possibility, several receptors associated to the TonB/ExbBD.system were tested. Single, double and triple mutants for FepA, Fiu and Cir receptors, that participate in the uptake of siderophore enterobactin and its hydrolytic products, were tested as putative receptors for microcin E492. The results demonstrate that a triple mutant strain in these three receptors is resistant to microcin E492. Other components related with the uptake of enterobactin, such as periplasmatic protein FepB or the inner membrane FepCDG, are not necessary for the uptake of microcin E492, because mutant E. coli strains fepB or fepC are sensitive to this bacteriocin. On the other hand, an increase in the density of these receptors in the outer membrane was related to higher sensitivities to microcin E492, suggesting that the expression of these receptors is limiting in the bactericidal action. FepA was found to be the most efficient receptors for microcin E492, while Fiu contributed in a moderate form and Cir participated when the microcin concentration were higher than 5 µM. The activity of microcin E492 was not inhibited by a synthetic peptide corresponding to the last 20 amino acids of the carboxyl-terminal of this bacteriocin, nor by antibodies directed against this region of microcin E492. This result suggests that recognition of E492 is a complex process and it does not involve a single region of the microcin. The ability of enterobactin, its hydrolysis products and the precursor DHB to act likes antagonists of microcin E492 activity was studied. The inhibition tests indicated that the main antagonists were the linear trimmer and enterobactin followed by the dimmer, being the monomer and DHB weaker inhibitors. Competition tests between enterobactin and microcin E492, using as indicator strain to mutants that express one or two of receptors FepA, Fiu and Cir, suggest a competitive inhibition mechanism. MceD protein, encoded by the microcin system has a 30% of identity with Fes enzyme of E. coli, an enterobactin esterase that breakdown enterobactin to release iron in the intracellular space. It is probable that some noncovalent association between hydrolytics products of an enterobactin derivative and the microcin E492 exists, which would make difficult the release of microcin E492. These assumptions are based on the phenotype of mceD::Tn5 mutant in which purified microcin cannot be detected in gels of poliacrilamida. When the mceD::Tn5 mutant is expressed in a strain that do not synthesize or import enterobactin, a protein band is observed in poliacrilamida gels, with identical mobility to microcin purified from the wild strain. This result suggests that in the absence of enterobactin or its hydrolytics products, MceD is dispensable. On the other hand, when the microcin E492 system (pJEM15) is expressed in E. coli H1885 (entDF), a strain defective in the enterobactin synthesis, an inactive microcin is produced. Circular dichroism analysis of microcin-entDF shows secondary structure with a higher content of a-helix than the wild type active microcin, that in turn presents a higher content of B-sheet structure. This behavior is similar to that observed in mutants in the maturation genes of microcin E492. In this case, the inactive form has a greater content in a-helix, while active microcin purified from the wild type strain is rich in ẞ-sheet structure. The inactive form produced by the E. coli H1885 (entDF) pJEM15, strain can be converted to the active form in the same manner than inactive miçrocin produced by mutants in maturation genes. Hypotheses that explain the relationship of microcin maturation and synthesis of molecules related to enterobactin are discussed.