Estudio de la enzima exopolifosfatasa (ppx) y otros determinantes de resistencia a Cu2+ del arqueón Metallosphera sedula

Abstract

El cobre es un elemento esencial para el desarrollo celular. Sin embargo, a concentraciones elevadas se vuelve tóxico. Por esta razón, los microorganismos han desarrollado mecanismos moleculares que les permiten disminuir el impacto provocado por la presencia de concentraciones elevadas de este metal en su entorno. Entre los posibles mecanismos de resistencia se ha planteado la idea que la presencia de los polifosfatos inorgánicos intracelulares (poliP) constituyen uno de los determinantes de resistencia a metales en bacterias y arqueones. Se ha descrito un modelo en Escherichia coli para la resistencia a cadmio, en el que se vinculan los poliP a la resistencia a metales, involucrando su hidrólisis mediada por la enzima exopolifosfatasa (PPX) y la posterior eliminación del metal, unido al fosfato liberado desde el poliP. Pese al modelo existente, el entendimiento de los mecanismos y los factores genéticos que determinan la resistencia a los metales en el medio de crecimiento en los miembros del dominio Archaea es insipiente. Por ello, la determinación de estos determinantes de resistencia es de mucho interés. En la presente Tesis se estudió el vínculo entre la presencia de poliP y la resistencia a cobre en el arqueón termoacidófilo Metallosphaera sedula, que es miembro del denominado "consorcio biominero" (nombre que se les da a los microorganismos presentes en ambientes biomineros). Este arqueón puede crecer en medios de bajo pH y a temperaturas que oscilan en un rango de 60 y 75 °C. Entre las características que posee este arqueón y que lo hace un sujeto interesante de estudio, está su potencial en el uso de sistemas de biolixiviación mediante reactores, ya que posee una alta eficiencia en la oxidación de minerales como pirita. Debido a su eventual importancia en el uso biotecnológico, es necesario comprender los mecanismos que este arqueón posee para resistir cobre para que en el futuro, cuando se posea una forma eficiente de manipulación genética para estos microorganismos, sean sujetos de mejoras genéticas que apunten a optimizar los sistemas de resistencia hoy estudiados. Con la idea de determinar cómo M. sedula es capaz de resistir a la presencia de cobre en el medio, se llevó a cabo el trabajo de tesis bajo la Hipótesis de que "El gen Msed_0981 de M. sedula codifica para la enzima PPX. Esta enzima junto a ortólogos de pho84 y del sistema cop son parte de los mecanismos de resistencia a cobre en esta célula'. Para comprobar la Hipótesis uno de los elementos de resistencia a cobre estudiados fue la presencia y dinámica de los gránulos de poliP observados en M. sedula. Se logró determinar su composición química y los niveles de poliP intraceluares de este arqueón tanto en condiciones control como en diversas condiciones de exposición a cobre, ya fuese en células adaptadas al metal o en células no adaptadas a cobre y en células expuestas a un "shock" de cobre. Se observó que la presencia de cobre provoca una disminución en la cantidad intracelular de poliP, de manera similar a lo descrito en otros microorganismos. Según lo observado la degradación de los poliP en M. sedula no es exhaustiva, lo que sugiere la posible presencia de algún sistema regulador de la degradación de los poliP. Como se mencionó, la degradación de los polip es efectuada por la enzima exopolifosfatasa (PPX), en M. sedula esta enzima aún no se ha caracterizado. Pero mediante un análisis bioinformatico se determinó que el producto del gen Msed_0981 codifica esta proteína. Se determinó la ubicación subcelular de la enzima en células de M. sedula usando inmunomicroscopía electrónica empleando anticuerpos contra la PPX de M. sedula. Se observó que la PPX se distribuye en agrupaciones en células de M: sedula expuestas o no a cobre; además, en las células expuestas se ve un aumento en el número de anticuerpos que reconocen la enzima. Se observó que la enzima PPX de M. sedula, a la que se midieron in vitro sus parámetros de funcionamiento, tales como temperatura óptima, concentración y necesidad de cationes divalentes, sustrato óptimo de reacción, cinética de reacción y el efecto del sustrato. Tiene una temperatura óptima de 65° C, una necesidad de Mg para el mejor funcionamiento, un poliP de 700 residuos de fosfato inorgánico (Pi) como sustrato óptimo, una cinética de carácter sigmoideo y una disminución en la actividad de la enzima en presencia de Pi. También se diseñó y generó mutantes para comparar el efecto de las mutaciones sitio dirigidas sobre la enzima, mostrando una nula actividad enzimática al mutar el amino ácido E113A. Los niveles de transcritos de genes involucrados en la respuesta a cobre que están presentes en el genoma de este arqueón se determinaron por qRT-PCR. Entre los genes estudiados se encuentran homólogos del transportador de Pi Pho84, el gen que codifica a la enzima PPX y los componentes del sistema Cop. Lo primero que se realizó fue una medición en diferentes puntos de la curva de crecimiento de M. sedula de los diferentes genes en diferentes condiciones: presencia, ausencia, adaptación, no adaptación y "shock" de cobre, con lo que se logró tener un panorama del dinamismo de los diferentes genes estudiados. Se observó diferencias en la expresión de los genes en las distintas etapas del crecimiento celular, pareciendo ser muy importante tener siempre presente algún transportador de Pi cuando la célula es expuesta a cobre. Adicionalmente frente a un "shock" de cobre se activa la expresión de los genes relacionados con la resistencia a este metal. Finalmente, para tener una visión más global de lo que le sucede en la célula en presencia de cobre, se efectuó un análisis cuantitativo de expresión de proteínas, el que se Ilevó a cabo por la técnica de iTRAQ. Los datos de este experimento, sometidos a un análisis de enriquecimiento, mostraron que existe una respuesta general de la célula ante la presencia de cobre. Se observaron cambios en muchos procesos celulares y en forma notoria la sobreexpresión de proteínas involucradas en la respuesta a estrés oxidativo, el que estaría vinculado directamente a la presencia del metal. En resumen, se determinó el efecto que causa el cobre en el arqueón M. sedula al exponerlo a cobre. La respuesta a cobre involucra desde la degradación de los poliP de forma parcial por la PPX hasta el montaje de sistemas específicos de respuesta a metal como el sistema Cop y la respuesta global de la célula a la respuesta a cobre mediante una respuesta a estrés oxidativo.

Copper is an essential metal for cell development. However, at high concentrations they become toxic. Therefore, microorganisms have developed molecular mechanisms that allow them to reduce the impact caused by the presence of high concentrations of these metal in the environment. One of the possible mechanism for metal resistance that have been proposed, is the idea that the presence of intracellular inorganic polyphosphate (polyP) a determinant for metal resistance in bacteria and arqueones. The model described in Escherichia coli for cadmium resistance, is linked to the polyP metal resistance mechanism, involving the enzymatic hydrolysis of polyP mediated by exopolyphosphatase (PPX) and subsequent removal of metal, attached to the phosphate released from the polyP. Despite the existing model, understanding of the mechanisms and genetic determinants for metal resistance in archaea is poorly understood. Therefore, the determination of these resistance determinants is a matter of great interest. In this thesis we have studied the link between the presence of polyP with copper resistance in the thermoacidophile archaeon Metallosphaera sedula, a member ofthe so called "biominer consortium" (the name given to the microorganisms presents in biominers environments). This archaeon is able to grow in low pH media and temperatures varying in the range of 60 to 75° C. Among the features that have this archaeon and make it an interesting subject of study, is the potential to be used in bioleaching reactors, since it has a high efficiency in the oxidation of minerals such as pyrite. Due to its eventual importance in the biotechnologyc use, it is necessary to understand the mechanisms that this archaeon has to withstand copper, so if in the future we possess an efficient form to handling genetics ofthese microorganisms, they will be subjects to genetic improvements aimed to optimize resistance systems studied today. To determine how M. sedula. is able to resist the presence of copper in the medium, the hypothesis is that "The Msed_0981 gene actually encode the PPX enzyme. This enzyme with orthologs of cop system and pho84 are part of the mechanisms of resistance to copper in this cell. " To test the hypothesis, one of the copper resistance mechanism studied was the presence and dynamic of the PolyP granules observed in M. sedula. It was possible to determine the chemical composition and levels of polyP in this archaeon under control conditions and in various conditions of exposure to copper, adapted to metal or not adapted to copper cells and in cells exposed to a "shock " of copper. It was observed that the presence of copper causes a decrease in the intracellular amount of polyP, similar to that described in other micro-organisms. As noted the degradacaión of polyP in M. sedula is not exhaustive, suggesting the possible presence of a regulatory system degradation of polyP. As mentioned, the degradation of polyP is made by the exopolyphosphatase enzyme (PPX). In M. sedula this enzyme has not been characterized yet, but by a bioinformatic analysis we determine that the product of Msed_0981 gene encoding this protein. Within the observed results we see a similar behavior seen in other microorganisms of various genres, where the presence of copper induces a decrease in the intracellular amount of polyP. In addition we determined that the degradation of poliP mediated by exopilifosfatasa (PPX) is not exhaustive, so arises the idea of a regulatory system for polyP degradation. Within the scope of studying the relationship of PPX and poliP granules, using immuno electron microscopy the subcellular localization of the enzyme in M. sedula was determined. Also the M. sedula's PPX was studied, it has been measured its operating parameters in vitro, such as optimum temperature, concentration and necessity of divalent cations, optimal substrate for reaction, reaction kinetics, product effect in the reaction. Finding an optimum temperature of 65° C, need of Mg for better functioning, polyP 700 as optimal substrate, a sigmoidal kinetic curve and a decrease in activity in presence of Pi. We also generated mutants to compare the effect of site-directed mutations, showing no enzyme activity by mutating the E113А. On a molecular level analysis, by qRT-PCR technique we measured the transcript levels of genes presents in the genome of M. sedula and that are involved in the response to copper. The studied genes include phosphate (Pi) transporter ortologus of Pho84, the gene encoding the PPX enzyme and components of Cop system. To have an outlook of the dynamic of the different genes studied, the first thing done was a measurement at different points ofthe growth curve ofM. sedula of the different genes in conditions of presence, absence, adaptation, not adapted and shock of copper. A different expression in transcripts levels are observed in the growth stages of cell. And it is seems to be very important to keep allways some Pi transporter active when the cell is exposed to copper. Furthermore we see that the answer to a shock of copper activates the expression of genes involved in this response. Finally it was made a quantitative analysis of protein expression, to find new determinants to copper resistance or have a more comprehensive view of what happens to the cell in the presence of copper. This analysis was made by the iTRAQ technique. The enrichment analysis made it to the data from this experiment, showed that in the presence of copper there is a general response of the cell involving many cellular processes, but assembly of oxidative stress response, which would be linked directly to the presence of metal seems to be the most huge global response of the cell. As it can be seen in the development of this study we have determined the effect of copper in the archaeon and the response of M. sedula by exposing the cell to copper in different ways, either adapted to the presence of copper, cells not adapted and in a shock of copper. Copper response is far from unique, involves the partial degradation of polyP by PPX to an installation of a specific response systems such as Cop and an overall system response like the response to oxidative stress.