Characterización of A16L and G9R vaccinia virus gene products

Abstract

Poxviruses comprise a large family of enveloped DNA viruses that replicate in the cytoplasm of infected cells. Among the members of this virus group are variola virus, the causative agent of smallpox and vaccinia virus, which was used as a vaccine strain against smallpox. Vaccinia virus, the best-studied member of the Poxviridae, has a double stranded-DNA genome of approximately 190 kbp encoding for nearly 200 polypeptides. The assembly of vaccinia is a multi-step process resulting in formation of two major infectious forms: the mature virus (MV) and the extracellular virus (EV), which contains an additional outer membrane. The mechanism used by vaccinia virus to enter cells is not completely understood yet. It involves a putative entry-fusion complex comprised of eight proteins that are incorporated in the viral membrane common to both the mature and extracellular forms. Two of these proteins are G9 and A16, which have common structural characteristics such as conserved cysteines and C-terminal transmembrane domain. In order to investigate their role in virus entry, I constructed two recombinant vaccinia viruses in which the synthesis of A16 or G9 protein is regulated by an inducer. The induced A16 and G9 proteins were found exposed on the membrane of mature infectious virions. Under conditions in which the expression of either G9 or A16 was repressed, the yield of infectious virus, as well as the plaque size, was greatly reduced. Attempts to isolate a mutant virus in which the A16L or G9R genes were deleted failed, suggesting that both proteins are essential for replication and have non-redundant functions. In cells infected with the A16 and G9 mutants in the absence of inducer, all stages of virus morphogenesis appeared normal and extracellular virions were found on the cell surface. Purified virions which were assembled in the absence of inducer, appeared morphologically normal but had very low infectivity, whereas their overall polypeptide composition including other components of the entry-fusion complex were similar to that of virions made in the presence of inducer or of wild type virions. A16 or G9-defficient virions were capable of binding to cells, however, penetration of cores into the cytoplasm and early viral RNA synthesis were barely detected. A16 and G9 proteins, as well as the other proteins comprising the complex, were required for virus-induced syncytium formation and cell-to-cell spread of extracellular virions. The requirement for so many proteins to enable poxvirus entry into cells and membrane fusion is unique among animal viruses.

La familia Poxviridae la conforman virus DNA con membrana cuyo ciclo replicativo ocurre en el citoplasma de la célula. Entre los miembros más conocidos de esta familia se encuentran los virus de la viruela y el virus vacuna, el cual fue usado como cepa viral para la campaña de erradicación de la viruela. El virus vacuna, el miembro más caracterizado de esta familia, tiene un genoma de DNA de doble hebra de aproximadamente 190 kilobases y codifica cerca de 200 polipéptidos. El ensamblaje del virus vacuna consiste en una serie de eventos que resultan en la formación de dos tipos principales de partículas infecciosas: los virus maduros (MV) y los virus extracelulares (EV) contienen una membrane externa adicional. Sin embargo, el mecanismo por el cual estas partículas entran a la célula aún se desconocen. Recientemente, un complejo de ocho proteínas fue aislado e identificado como possible complejo de entrada y fusión viral. Algunas de estas proteínas son incorporadas en la membrana viral común tanto en las formas maduras como en las extracelulares del virus vacuna. Dos de estas proteínas, identificadas como A16 y G9, comparten similares características estructurales como un dominio transmembrana en su extremo C-terminal y numerosos residuos conservados de cisteínas. Con el objetivo de investigar su papel durante la entrada del virus a la célula, se construyeron dos virus recombinantes en los cuales la síntesis de la proteína A16 o G9 está regulada por medio de un inductor. En los virus maduros (MV) purificados a partir de células infectadas con cada uno de estos virus recombinantes en condiciones permisivas, ambas proteínas fueron incorporadas en la superficie de la membrana viral con su dominio N-terminal hacia afuera de la partícula. En condiciones donde la expresión de A16 y G9 fue reprimida, se obtuvo un menor tamaño de placa y una menor cantidad de partículas infecciosas. Esta observación nos sugiere que tanto la proteína.A16 como la proteina G9 podrían no ser esenciales para la replicación viral. Sin embargo, no fue posible de aislar virus mutantes con deleción en estos genes, indicándonos que ambas proteínas son esenciales para la replicación viral y sus funciones durante el ciclo viral no son redundantes. En células infectadas con el mutante A16 o G9 en ausencia del inductor, todos los estadíos del ensamblaje viral ocurrieron normalmente y viriones extracelulares se observaron en la superficie de la célula. Las partículas virales ensambladas en ausencia del inductor presentaron una morfołogía normal pero resultaron ser menos infectivas. Por el contario, su composición polipeptídica incluyendo otras proteínas del complejo entrada-fusión fue similar a la de los viriones ensamblados en presencia del inductor o a la de los viriones tipo silvestre. Los viriones deficientes en A16 o G9 fueron capaces de unirse a la membrana celular pero sus cores no pudieron entrar a la célula y la síntesis de RNA viral temprano apenas fue detectada. Las proteínas A16 y G9 también fueron necesarias para la formación de sincicios inducida por el virus vacuna y para la propagación célula a célula mediada por los viriones extracelulares. Dicha correlación entre entrada viral y fusión también fue observada en algunas de las proteínas que componen el complejo entrada-fusión. La interacción específica entre componentes de dicho complejo con las proteínas A16 y G9 fue demostrada mediante ensayos de immunoprecipitación con anticuerpos específicos para proteínas del complejo. El requerimiento de tantas proteínas para permitir la entrada de los poxvirus a la célula y permitir la fusión de membrana es un evento único entre los virus animales.