Transferencia genética horizontal como mecanismo evolutivo en vibrio parahaemolyticus

Abstract

Vibrio parahaemolyticus es una especie bacteriana marina asociada a mariscos capaz de causar diarrea en humanos. Las bacterias de esta especie contienen 11 copias de operones de RNA ribosomales (rrn). La presencia de tantos genes repetidos requiere un mecanismo para evitar que los genes 16S rRNA (rrs), 23S rRNA (rrl) y 5S rRNA (rrf) que conforman este operón se vayan diferenciando. El fenómeno de mantención de la misma secuencia en los genes repetidos, denominado "evolución concertada", sólo ha podido ser explicado con teorías. Existen cepas de V. parahaemolyticus, como la RIMD2210633 (VpKX), con copias idénticas de los genes rrs presentes en los 11 rrn. Sin embargo, otras como la ATCC17802 (VpD), muestran heterogeneidad entre sus rrs. У Esta tesis caracterizó inicialmente la extensión y diversidad de la heterogeneidad en los rrs de V. parahaemolyticus en aislados clínicos y ambientales obtenidos de mariscos, pertenecientes a grupos genotípicos distintos, diferenciados por sus patrones de restricción del genoma (DGREA). Aproximadamente el 62% de los aislados mostraron heterogeneidad intragenómica en sus rrs, conteniendo en total 16 secuencias diferentes dentro de un segmento de 25 nucleótidos ubicado entre los nucleótidos 455 - 479 del 16S rRNA (según el 16S rRNA de Escherichia coli). A pesar que los sitios diferentes pueden constituir 12 a 48% de los sitios nucleotídicos, cada segmento conserva la estructura de horquilla o "stem-loop" característica de esta región del rrs. La acumulación de tantas sustituciones con cambios compensatorios implica que la divergencia de los diferentes rrs es relativamente muy antigua. La explicación más adecuada de nuestros resultados es que la heterogeneidad en los rrs se genera por recombinación entre segmentos de rrs que provienen de distintas bacterias. La alta proporción de aislados ambientales con heterogeneidad (62%) sugiere que la transferencia lateral y la recombinación son frecuentes entre cepas de V. parahaemolyticus. Esta transferencia se daría entre especies del género Vibrio ya que las secuencias encontradas en las variantes se observan sólo en bacterias de este género. La población de V. parahaemolyticus en mariscos es muy diversa, habiéndose encontrado desde el 2004 al 2007 un total de 23 cepas genotípicamente distintas sólo en el Seno de Reloncaví (región de Puerto Montt). En cambio, la población de V. parahaemolyticus en los casos clínicos sólo incluyó hasta el 2006 aislados de la cepa clonal pandémica que contiene rrs idénticos. El 2007 se detectó una nueva cepa clínica que a diferencia de las anteriormente encontradas mostraba diferencias entre sus rrs. Este nuevo grupo de aislados clínicos, cuya cepa tipo es РMС38.7, causó aproximadamente el 13% de los casos del brote de V. parahaemolyticus en Puerto Montt en el verano del 2007. El análisis de sus genes rrs mostró heterogeneidad con la presencia de 3 secuencias diferentes. La caracterización detallada de esta cepa, incluida en esta tesis, mostró que contiene genes de virulencia idénticos a VpKX (сера pandémica) aunque pertenece a un complejo clonal distinto al pandémico, causante de la mayoría de los brotes antes reportados en esta misma región, Siete genes "housekeeping" muestran en cambio diferencias nucleotídicas de un promedio de 1.5%. Los genes de virulencia encontrados en esta cepa corresponden a genes del sistema de secreción tipo III ubicados en una isla de patogenicidad en el cromosoma 2 (SSTT2) de VpKX. La presencia de genes del SSTT2 idénticos a los de VpKX en bacterias que difieren en sus genes "housekeeping" y en sus patrones DGREA, sumada a la heterogeneidad de sus rrs, sugiere que la cepа РМС38.7 se originó por transferencia horizontal de la isla de patogenicidad desde VpKX a una cepa ambiental. De acuerdo a estos resultados entendemos ahora que la población de V. parahaemolyticus en mariscos está conformada por grupos genotípicos distintos que pueden, por transferencia lateral, intercambiar con alta frecuencia genes rrs y genes relacionados con patogenicidad, generando nuevas cepas potencialmente patógenas.

Vibrio parahaemolyticus is a bacteria associated with shellfish and cause diarrhea in humans. Bacteria of this specie contain 11 copies of ribosomal RNA operons (rrn). The presence of so many repeated genes require a mechanism to prevent genes 16S rRNA, 23S rRNA and 5S rRNA, that conforms rrn operon, continue differentiating. The phenomenon for maintaining the same sequence in the repeated genes, called "concerted evolution", could only be explained with assumptions. There are strains of V. parahaemolyticus, as RIMD2210633 (VpKX) with identical copies of rrs genes present in the 11 rrn. However, others strains such as the ATCC17802 (VpD) show heterogeneity among its rrs. This thesis initially characterized the extent and diversity of heterogeneity in the V. parahaemolyticus rrs genes in clinical and environmental isolates obtained from seafood that belonging to different genotypic groups, differentiated by their restricted genome (DGREA). Approximately 62% of isolates showed heterogeneity intragenomic in their rrs, containing a total of 16 different sequences within a segment of 25 nucleotides located between nucleotides 455 - 479 of the 16S rRNA (according to the 16S rRNA from Escherichia coli). Despite the different sites may constitute 12 to 48% of nucleotide sites, each segment retains the hairpin structure or "stem-loop" characteristic of this region of rrs. The accumulation of so many substitutions with compensatory variations means that the divergence of different rrs is relatively very ancient. The most appropriate explanation of our results is that the heterogeneity in the rrs is generated by recombination between rrs segments from different bacteria. The high proportion of environmental isolates with heterogeneity (62%) suggested that the horizontal transfer and recombination are common among strains of V. parahaemolyticus. This transfer would be between species within the genus Vibrio because the sequences found in the variants are found only in bacteria ofthis genus. V. parahaemolyticus population in seafood is very diverse, revealing from 2004 to 2007 a total of 23 strains genotypically different only in the Reloncaví Inlet (region of Puerto Montt). In contrast, V. parahaemolyticus population in clinical cases included only the clonal pandemic strain isolates until 2006, which contain rrs identical. In 2007 was detected a new clinic strain that differ those previously found showed differences between their rrs. This new group of clinical isolates, whose type strain is PMС38.7, caused approximately 13% of cases in the V. parahaemolyticus outbreak in Puerto Montt in the summer of 2007. The analysis of their rrs genes showed heterogeneity and the presence of 3 different sequences. The detailed characterization of this strain, showed that contains virulence genes identical to VpKX (pandemic strain) but belongs to different clonal complex than pandemic, the source of most of the outbreaks reported earlier in the same region. Seven gene "housekeeping" show nucleotide differences in average of 1.5%. The virulence genes found in this strain correspond to type III secretion system genes located on the pathogenicity island on the chromosome (SSTT2) in VpKX. The presence of SSTT2 genes identical to those of VpKX in bacterial that differ in their "housekeeping" and their DGREA, coupled with the heterogeneity of their rrs, suggested that the strain PMC38.7 was originated by horizontal transfer of the pathogenicity island from VpKX to an environmental strain. a 2 According to these results, we understand now that V. parahaemolyticus seafood population is conforming different genotypic groups that may, by lateral transfer, exchange to high frequency rrs genes and genes associated with pathogenicity, generating new potentially pathogenic strains.