Análisis de las modificaciones post-traduccionales de la proteína NSP5 de rotaviirus y efecto de su expresión en trans sobre el ciclo viral

Abstract

Rotavirus pertenece a la familia Reoviridae y presenta un genoma de 11 segmentos de RNA doble hebra. El proceso de síntesis de hebras negativas de RNA utilizando como templado el RNA de polaridad positiva viral se denomina replicación y ocurre en estructuras subcelulares denominadas viroplasmas. NSP5 es una fosfoproteína viral que forma parte de los viroplasmas y es esencial para la replicación. La no disponibilidad de un sistema de genética reversa para NSP5 ha impedido hasta el momento estudiar el rol preciso de esta proteína, así como el de sus modificaciones post-traduccionales en el ciclo viral. Como una alternativa en este trabajo se propuso el desarrollo de un sistema de transcomplementación basado en el uso de siRNA para bloquear la expresión viral de NSP5 combinado con la expresión en trans de la proteína utilizando un sistema lentiviral. Sorprendentemente, al realizar los ensayos de transcomplementación, se observó que la expresión de NSP5 recombinante (trNSP5) en un momento previo a la infección era capaz de inhibir el ciclo viral. Al analizar las distintas variables, asociadas a diferentes estadios del ciclo viral, tales como: la formación de partículas, la producción de viroplasmas (replicación y ensamblaje viral), la síntesis de dsRNA (replicación viral) y proteínas (traducción viral), pudimos observar que este efecto inhibitorio ocurre en eventos tempranos previos a la replicación. Al aumentar el número de partículas de Rotavirus con que se infecta la célula (MOI), pudimos revertir parcialmente este efecto inhibitorio, sugiriendo un rol de la partícula de doble cubierta (double layer particle -DLP-) en este fenotipo. Sin embargo, no se pudo observar una interacción directa de NSP5 con la DLP. Tampoco se observó una alteración en el actividad transcripcional de la DLP in vitro, por acción de NSP5. Esto sugiere que la acción inhibitoria de NSP5 no ocurre sobre la DLP sino más bien en eventos post-transcripcionales previos a la replicación, donde un mayor número de DLPs permite un aumento del mRNA viral, lo que neutralizaría la inhibición. Además, se realizó un análisis de las modificaciones post-traduccionales de NSP5 durante la infección por medio de espectrometría de masas. En este análisis se cubrió más de un 95% de la secuencia de NSP5. Se identificaron 9 sitios, que presentaban diferentes grados de fosforilación. Al comparar los sitios identificados no se observaron diferencias entre las isoformas 26, 28 y 35 kDa, además se realizó un análisis cuantitativo del porcentaje de fosforilación. Nuestros resultados sugieren que los cambios en la migración de NSP5 no se deben a la fosforilación en un sitio específico sino mas bien a un aumento en las fosforilaciones en diferentes posiciones También se logró identificar otras modificaciones post-traduccionales tales como la acetilación de la serina 2 y la formación de un puente disulfuro intracadena. Se discute la conservación de estas modificaciones entre cepas de Rotavirus y su posible rol.

Rotavirus belongs to Reoviridae family and it has a genome composed by 11 segments of double strand RNA (dsRNA). The synthesis of negative strands of RNA using positive strand RNA as template is called replication and occurs in subcellular structures called viroplasms. NSP5 is a viral phosphoprotein that is part of the viroplasm and it is essential for the replication. a The lack of a reverse genetics system for NSP5 has hindered efforts to define the role of posttranslational modifications and enzymatic activities of NSP5. As an alternative, we have attempted to develop a trans-complementation system that uses siRNA to block viral NSP5 expression in infected cells combined with a lentivirus-based expression system that supports production of NSP5. Surprisingly, when transcomplementation assays were carried out, we found that expression of the recombinant NSP5 (trNSP5) previous to infection, was able to inhibit the viral cycle. Different variables associated with different stages of viral cycles were analyzed, notably particle production, replication and protein synthesis. We found that this inhibitory effect occurs early in the infection in a period previous to replication. An increase in the MOI partially reverted the inhibitory effect, suggesting a role of the double layer particle (DLP) in this phenotype. However we were not able to establish a direct interaction between NSP5 and DLP. Neither, we observed an effect of trNSP5 in the in vitro transcriptional activity of DLP. This suggests that DLP is not directly involved in NSP5 inhibitory effect. These results suggest that this effect occurs in a period after transcription and previous to replication. Also we carried out an analysis of NSP5 post-translational modifications by mass spectrometry (MS). Using different enzymatic digestions almost 95% of the NSP5 sequence was covered by MS experiments. Nine different phosphorylated sites were found with diverse phosphorylation degrees. No differences with respect to phosphorylation positions were found between isoforms. Additionally, our results suggest that changes in the migration of NSP5 are not due a phosphorylation in a specific position but well to an increase in phosphorylation of different positions. Moreover, we identified an N-acetylation in serine 2 and an intermolecular disulfide bond. In this thesis we discuss the relevance and conservancy of these modifications.