Caracterización estructural y funcional del regulador transcripcional fur : su papel en el control de la homeostasis de hierro en acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270

Abstract

En condiciones ambientales acídicas, el hierro es soluble a concentraciones que superan los requerimientos bacterianos del ion, aspecto relevante si se considera que excesos intracelulares de hierro generan estrés oxidativo. Además de Acidithiobacillus ferrooxidans, pocos organismos conocidos enfrentan estos extremos de acidez y en ningún caso han sido caracterizados los mecanismos de mantenimiento de la homeostasis de hierro en este tipo de microorganismos. La presencia y conservación en el genoma de A. ferrooxidans de genes de transporte de Fell y Felll-sideróforos y de genes de almacenamiento intracelular del metal, indicaría por analogía con sistemas conocidos, que esta bacteria es capaz de montar una respuesta integral para preservar la homeostasis de hierro. Adicionalmente, se ha identificado en el genoma de A. ferrooxidans un ortólogo del regulador Fur (ferric uptake regulator) implicado en otros sistemas en la modulación de esta respuesta. el En virtud de la similitud de secuencia y la conservación de motivos funcionales específicos, se sustenta la asignación del ortólogo FurFe de A. ferrooxidans a la subfamilia de reguladores Fur de respuesta a hierro. La reactividad cruzada de esta proteína con anticuerpo generado contra la proteína Fur de E. coli, la capacidad de complementar la deficiencia del regulador en un sistema heterólogo y la capacidad de unión de la proteína a cajas Fur in vitro respaldan tal proposición. Mientras la expresión de Fur de A. ferrooxidans en E. coli a altos títulos de proteína, en presencia de hierro, reprime de modo clásico la expresión de dos genes Fur dependientes de E. coli, inesperadamente, este regulador activa la expresión los mismos genes blanco, cuando sus títulos de proteína son bajos. El efecto activador puede ser extendido a un número mayor de genes típicamente reprimidos por Fur en E. coli, según lo indica la sensibilidad aumentada frente a H₂O2 de la cepa fur de E. coli que expresa bajos títulos del represor Fur de A. ferrooxidans. Se sugiere que el efecto diferencial sobre la expresión génica, observado en E. coli en función de los títulos celulares de Fur, podría ser significativo en la regulación génica de A. ferrooxidans donde Fur demostró expresarse a títulos variables según la carga de hierro del medio de crecimiento. La búsqueda de cajas Fur en el genoma de A. ferrooxidans evidenció la existencia de posibles cajas Fur que conservan los residuos involucrados en el contacto DNA-proteína en E. coli. Sin embargo, A. ferrooxidans se diferencia de otros microorganismos en que sus cajas no se encuentran inmersas en operadores complejos, consistentes de múltiples cajas superpuestas entre sí y a su promotor, y que median la represión por Fur en otros sistemas. En función de este análisis se sugiere que la localización promotor-específica de las cajas Fur de A. ferrooxidans podría determinar la represión o activación Furdependiente de los genes blanco asociados. La adaptación de un mecanismo de regulación, de por si sensible a las concentraciones de hierro, como el de Fur para regular diferencialmente ciertos subconjuntos de genes, tiene especial sentido en un sistema como A. ferrooxidans que enfrenta la necesidad de balancear una inusualmente elevada demanda de hierro como fuente de electrónes, con la de protegerse frente a exposiciones significativamente mayores del metal respecto de otros microorganismos.

Iron solubility in acidic environments significantly exceeds the average bacterial requirement. This is an important issue since excess of intracellular iron can impose severe oxidative stress. The y proteobacterium Acidithiobacillus ferrooxidans and several other Bacteria and Archaea tolerate extremely acid pHs. However, in no case have the mechanisms by which they maintain iron homeostasis been investigated. Bioinformatic analysis of the A. ferrooxidans genomic sequence has revealed the presence of well conserved putative proteins involved in transport and storage of iron that are typically modulated in response to iron levels to preserve homeostasis in other microorganisms. In addition, a candidate furr. (Ferric Uptake Regulator) gene that functions as a global regulator of iron uptake and homeostasis in most microorganisms has also been identified in A. ferrooxidans. On the basis of its significant sequence similarity, including conservation of functional motifs, it is proposed that this gene is a Fur ortholog. The candidate furFe gene was cloned and expressed in E. coli. A. ferrooxidans FurFe was cross reactive to antiserum raised against E. coli Fur experimentally supporting its bioinformatics identification as a Fur ortholog. In addition, A. ferrooxidans furre was able to complement fur deficiency in an iron-responsive manner in an E. coli mutant. The protein was also able to specifically bind to Fur boxes in vitro. Whereas Fur represses gene expression from two classical E. coli Fur-responsive promoters at high cellular concentrations, unexpectedly it increases gene expression from these promoters at low concentrations. Increased sensitivity of this clone to H2O2 suggests that activation can be extended to other Fur-dependent promoters that presumably aggravate the iron induced oxidative stress when being actively expressed. We suggest that the differential effect on gene expression detected in E. coli in response to changing titres of Fur from A. ferrooxidans could be especially relevant to understanding gene regulation in A. ferrooxidans where Fur protein titres unexpectedly decrease with increasing iron concentrations in the growth medium. A bioinformatics inspection of potential Fur binding sites in the genome of A. ferrooxidans reveals certain differences compared to similar sites in other microorganisms. The majority of Fur boxes in microorganisms are organized in complex, repeated and often overlapping units. This complexity provides a basis for polymerization-mediated repression of gene expression by Fur. In contrast, predicted Fur boxes in A. ferrooxidans appear to be solitary or at most with few repeats. We speculate that, in A. ferrooxidans, the position and strength of such boxes relative to the promoter dictates whether Fur serves as an activator or a repressor of the gene in question. Such a strategy would be especially useful for bacteria like A. ferrooxidans facing the concomitant need to induce specific subsets of genes in order to meet electron requirements by oxidizing large amounts of iron, and at the same time repress other genes to avoid the oxidative stress threat imposed by a unique iron-rich condition.