Biosensores de ADN basados en nanotubos de carbono modificados químicamente

Abstract

Muchos de los desórdenes genéticos conocidos en la actualidad son provocados por cambios en el ADN, ya sea heredados o producidos por daño del material genético, por lo que la detección de estas secuencias específicas y/o su daño es muy importante. En la actualidad se han descrito numerosos métodos para detectar ADN, siendo los biosensores electroquímicos o genosensores los que ofrecen una alternativa de detección continua, rápida, sensible y selectiva. En esta Tesis se desarrollaron nuevos genosensores basados en nanotubos de carbono (NTC) modificados químicamente. Primero, los NTC fueron funcionalizados con grupos que generan cargas positivas en disolución (NTC-NH2), a través de uniones covalentes del tipo amida. Esto permitió dispersarlos en medio acuoso, evaluar su interacción en disolución con ADN y favorecer la inmovilización de éste sobre electrodos modificados, sin utilizar agentes dispersantes catiónicos. La caracterización de estas funcionalizaciones se realizó a través de diferentes técnicas espectroscópicas (FT-IR, Raman, XPS) y microscópicas (HR-TEM, SEM), entre otras; mientras que los electrodos modificados se caracterizaron por diferentes técnicas electroquímicas (VC, VPD). Estos electrodos mostraron ser altamente reproducibles y sensibles en la detección de ADN. En segundo lugar, se generaron biosensores para estudios de hibridación a partir de NTC funcionalizados con un oligonucleótido de hebra simple (ss-ODN). Se evaluaron dos formas de inmovilización: adsorción directa y unión covalente; y se estudió la respuesta electroquímica de ambos sistemas. La caracterización de estas funcionalizaciones se llevó a cabo con diferentes técnicas electroquímicas (VC, VPD, SECM), las que permitieron proponer la conformación que adoptaría el oligonucleótido sobre el NTC que dependió del tipo de funcionalización realizada. Los electrodos modificados fueron empleados para estudios de hibridación indicando que ambas conformaciones de ss-ODN sobre el nanotubo permiten la hibridación de hebras complementarias, resultados que fueron corroborados con la utilización de un agente intercalante electroactivo como azul de metileno. Finalmente, se determinó que la funcionalización por adsorción del NTC con oligonucleótidos es más sensible a la detección del proceso de hibridación que la funcionalización covalente.

Many genetics disorders known nowadays are caused by changes in DNA, either inherited or caused by damage of genes, so that the determination of a specific sequence and/or its damage is very important. Currently, many techniques have been described to detect DNA, being the electrochemical biosensors or genosensors the ones that offer a continuous, fast, sensitive and selective detection. This thesis developed new DNA biosensors based on chemically modified carbon nanotubes (CNT). On one side, CNTs were covalently functionalized with groups that generated positives charges in solution (NTC-NH2). These modifications allowed their dispersion in aqueous media, to evaluate their interaction with DNA in solution and to improve their immobilization onto modified electrodes without using cationic dispersants. The characterization of modified CNTs was performed by different spectroscopic (IR, Raman, XPS) and microscopic (SEM, HRTEM) techniques, among others. Whereas, modified electrodes were characterized by different electrochemical techniques (CV, DPV). The resulting electrodes proved to be highly reproducible and sensitive in the detection of DNA. On the other hand, biosensors for hybridization were also generated. For this purpose, functionalized CNTs with a single strand oligonucleotide (ss-ODN) were used. Two methods of immobilization were evaluated: direct adsorption and covalent attachment, and the electrochemical behavior of both systems were characterized. The results allowed to propose two different spatial conformations of the oligonucleotide on the CNT depending of the type of functionalization. The modified electrodes were applied in hybridization studies revealing that both conformations of ss-ODN upon nanotube allowed the hybridization between complementary strands. This fact was corroborated by using an electroactive intercalant agent such as Methylene blue. Finally, we determined that the functionalization of CNT through direct adsorption of the oligonucleotide is more sensitive to detect the hybridization than the covalent functionalization.