Estudio del efecto de las ondas de choque sobre colágenos y elastina

Abstract

Las ondas de choque (OCh) se están aplicando en medicina para la cura de tendinopatías y de traumatismos óseos. Los resultados después de algunas semanas del tratamiento con OCh se traducen en neoangiogénesis e hipercelularidad, lo que lleva a la reparación tisular. Los bio-procesos descritos no tienen aún explicación molecular. Datos en biopsias relativos a estudios immunohistoquímicos de tejidos tendinósicos, indican que son los componentes colagénicos los que experimentan los mayores cambios. Sobre esta base, se estudió a través de espectroscopía Raman el efecto que tienen las OCh sobre colágenos y elastina, ambas proteínas presentes en tejidos de tendón. El objetivo principal de este trabajo es dar una explicación molecular al origen de los bioprocesos observados en los tejidos tratados con OCh. Para materializar el objetivo señalado, se construyó una amplia base de datos Raman y/o SERS, constituida por los 20 aminoácidos estándar, hidroxiprolina (ОНPro), péptido Cys-Lys-Pro-Phe-Phe-Asp, colágenos modelo tipo I y tipo III extraídos de rata y de bovino y elastina. Centramos nuestros estudios vibracionales Raman y SERS en los componentes aminoacídicos estructurales más abundantes de los colágenos, esto es glicina (Gly), alanina (Ala), prolina (Pro) y OH-Pro. Debido a que Pro y OH-Pro son determinantes en la estructuración molecular de los colágenos, fueron exhaustivamente estudiados, determinándose a partir de un completo análisis Raman, SERS y teórico computacional, que es el grupo hidroxilo quien favorece cinética y termodinámicamente la interacción del aminoácido con superficies metálicas; esto permite inferir que la conformación de los colágenos es altamente dependiente de la presencia de Pro y OH-Pro. Las señales de las prolinas fueron claramente identificadas en los espectros Raman de colágenos, así como también las señales de fenilalanina (Phe). Sin embargo, en los espectros SERS de colágenos, el residuo de Phe es el que se identifica más claramente. Este hecho, dió cuenta que los residuos de Pro y Phe responden cinética y termodinámicamente a la presencia de nanoestructuras (NES) metálicas. Este resultado SERS fue contrastado con el comportamiento espectral de un péptido modelo de 6 aminoácidos que contiene grupos Phe y Pro, donde la interacción con la superficie metálica se materializó a través de Phe. Previo al estudio del efecto de las OCh sobre los colágenos modelo, se realizó una completa caracterización de estas proteínas, observando primero el nivel de organización de los colágenos a través de sus imágenes AFM, luego, haciendo un exhaustivo análisis Raman. Se determinó, que los colágenos presentan niveles de organización del tipo fibras, fibrilla y microfibrillas, y que además, todos los colágenos modelo presentan una estructura secundaria del tipo triple hélice de colágeno. Por otra parte, el completo análisis vibracional Raman de elastina, dió cuenta que esta proteína presenta una estructura secundaria del tipo ovillo al azar. A partir de la base de datos generada y los estudios de interacçión se abordó el trabajo sobre los colágenos modelo y elastina, registrando y analizando sus espectros Raman con y sin tratamiento de OCh. La participación de cada aminoácido en los colágenos permitió inferir sobre variaciones conformacionales por efecto de las OCh en diversos períodos de tiempo. La certeza de esta observación fue contrastada con experimentos en los que no se utilizó el tratamiento de OCh. El resultado más relevante para los colágenos se refiere a la modificación conformacional expresada en las primeras horas después de aplicadas OCh, pero que deja de influir entre la primera y tercera semana. A partir de ese instante los sistemas colagénicos vuelven a su estado conformacional original. Con el fin de corroborar lo deducido de estudios inmunohistoquímicos es que analizamos el efecto de OCh a través de los espectros de elastinas modelo, sin que hubiera modificación espectral Raman en todo el período post OCh. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo ha permitido demostrar, por primera vez, que los colágenos son modificados conformacionalmente por las OCh. Finalmente, aún estamos lejos de interpretar molecularmente los bioprocesos de neoangeogénesis e hipercelularidad, que llevan a la reparación tisular; sin embargo, los hallazgos de esta tesis, permiten proponer que la modificación conformacional de los colágenos post OCh sería uno de los factores que participa en las etapas tempranas del proceso de reparación tisular.

Shockwaves (SW) are being applied in medicine for the cure of tendinopathy and bone trauma. Neo-angiogenesis stimulation and hypercellularization result from short periods of treatment, leading to tissue repair. The bio-processes described have no molecular explanation yet. Data on biopsies on tissue immunohistochemical studies indicate that specific sectors are complex biological system which are affected the most by SW. In particular, the collagenous components are experiencing the biggest changes. On this basis, it was studied by Raman spectroscopy the SW effect on the collagen and elastin, both protein present in tendon tissue. The main objective of this thesis is to give a first molecular explanation to the origin of bioprocesses observed in tissues treated with SW. To accomplish the above aim, a large database of Raman and/or SERS was built, consisting of the 20 standard amino acids, hydroxyproline (OH-Pro) peptide Cys-LysPro-Phe-Phe-Asp, collagens model type I and type III extracted from rat and bovine, and elastin. We focus our vibrational Raman and SERS studies on structural components most abundant amino acid collagens, namely glycine (Gly), alanine (Ala), proline (Pro) and OH-Pro. OH-Pro and Pro are determinants in the molecular arrangement of the collagens, and are responsible of the secondary structure of this protein. It has been determined from a complete analysis of the Raman and SERS data and theoretical computational that is the hydroxyl group which kinetically and thermodynamically favours the interaction of the amino acid with metal surfaces. On this basis it has been inferred that the conformation of collagen is highly dependent on the presence of OH-Pro and Pro. Prolines signals were clearly identified in the Raman spectra of collagen, as well as signals from phenylalanine (Phe). The Phe residue is clearly identified in the SERS spectra of collagens. This fact indicated that Pro and Phe residues drive the interaction with metal nanostructured surfaces. This result was compared with the SERS spectrum of a model peptide containing 6 amino acids including Phe and Pro where the interaction with the metal surface is verified through the Phe residue. A complete structural characterization of the proteins was performed. The level of organization of the collagens was studied through their AFM images; it has been determined that collagens display fibber, fibril and microfibril type organizations. The Raman data on collagens and elastin allow to propose that both proteins display a random coil type conformation. The SW treatment effect on collagens and elastin was inferred from the Raman spectra before and after the SW treatment. Raman spectra were registered after two hours, a week, and two and three week of the SW treatment. Similar experiments were performed without SW treatment. Collagen conformational modifications are evidenced in the first hours after SW treatment; modifications stop after some. days and the molecular systems start to back to their original conformations from the end of the first week of the SW treatment. At the end of the third week SW effect, collagens display the original conformation. No Raman spectral modifications after SW treatment were observed for elastin, thus supporting the immunohistochemical studies in tissues indicating that the collagen areas were affected the most by SW treatment. The set of results obtained in this study has demonstrated, for the first time that the collagens are conformationally modified by SW. Finally, we are still far to a molecular interpretation of the neoangeogenesis and hypercellularity bioprocesses, leading to tissue repair; however, the findings of this thesis, allow to propose that the conformational modifications of collagens after SW could be involved in the early stages of tissue repair processes.