Silenciamiento inducible de hma1 como sistema para estudiar su rol en la homeostásis de calcio

Abstract

El Calcio cumple un rol fundamental en ciertos mecanismos de señalización celular; frente a un estímulo, la concentración de calcio citosólico aumenta provocando una cascada de señalización la cual termina en una respuesta celular en distintos niveles. El retículo endoplásmico y la vacuola son organelos que funcionan como reservorios de Calcio, los cuales frente a un estímulo liberan el calcio hacia el citosol. En células animales se ha descrito que el aparato de Golgi actúa de similar manera, sin embargo en células vegetales se ha visto que éste no actúa como un reservorio de calcio, sino que estaría actuando como un recolector de calcio, ayudando a restablecer los niveles basales. de En la membrana del aparato de Golgi se han descrito una serie de mecanismos de transporte, nno los cuales es inhibible por el sesqui terpeno thapsigargina (inhibidor específico de SERCA ATPasas). Por estudios bioinformáticos el mejor candidato para poseer esta actividad es la proteína transportadora HMA1. HMA1 se ha descrito como un transportador de metales pesados. Experimentos de expresión heteróloga en levaduras han demostrado que HMA1 es capaz de dar tolerancia a Cd² y de recuperar un fenotipo sensible a la falta de Cat2, Ensayos de transporte en estas levaduras indican que HMA1 es capaz de transportar calcio y que este es inhibido por thapsigargina. Esta tesis se enfocó en el desarrollo de un sistema para el estudio de HMAl en Arabidopsis thaliana y su papel en la homeostasis de calcio, mediante el silenciamiento del gen que codifica para dicha proteína. Para esto se diseñó, generó y clonó un RNA interferencia inducible para hmal, el cual consistió de una secuencia de 365 pb del gen de hmal en dirección sentido, seguido del tercer intrón del gen de la actina 11 y finalizado con la misma secuencia de hmal en dirección antisentido. Este constructo se dejó bajo el control de un promotor incompleto, el cual necesita de la unión de un activador transcripcional para su activación. Dicho activador está codificado en el vector y es inducible por estradiol. Se línea transformaron 3 líneas de A. thaliana con el RNA interferencia. La primera es una "wildtype". La segunda es una línea que expresa la proteína lumicente Aequorina libre en el citosol (Aeqcit) y la tercera línea expresa Aequorina destinada al aparato de Golgi (Aeqgol). La transformación fue comprobada por PCR para el gen de resistencia al antibiótico higromicina. Se -identificaron 18 líneas transformantes para la linea "wildtype", 15 para la línea Aeqcit y 15 para la línea Aeqgol. De las líneas transformadas, sólo se analizó el RNA interferencia en la línea "wildtype". En esta se observó el silenciamiento de hmal mediante geles de agarosa. Este silenciamiento fue confirmado posteriormente finalizada esta tesis, mediante RT-PCR de tiempo real. Por otra parte, se estudiaron las variaciones de calcio frente a un estímulo abiótico como el frío. Se observó que las variaciones en la concentración de calcio citosólico producida al generar un estimulo de frío fue similar (en forma y amplitud de la espiga) en plantas completas y protoplastos, siendo esta última un poco más prolongada. Las variaciones de calcio observadas en el aparato de Golgi concuerdan con lo visto en plántulas, las cuales se caracterizan por un aumento diferido (no ocurre en el mismo instante del estímulo) y el aumento es gradual demorando aproximadamente 10 minutos en llegar al nivel máximo. Con esta caracterización de la respuesta de calcio en el citosol y en el aparato de Golgi, se compararán las respuestas de las plantas silentes en hmal para determinar el papel de este factor en la homeostais de calcio.

Calcium plays a fundamental role in some cell signaling processes; in response to a stimulus, the calcium concentration increases producing a signaling cascade which ends in a response. The endoplasmic reticulum and the vacuole are organels that function as calcium reservoirs, which liberate calcium to the cytosol in response to a stimulus. In animal cells, the Golgi apparatus has shown to act in a similar way, whereas in plant cells it acts as a calcium collector, helping to restore its basal levels. Several transport mechanisms have been described in the Golgi apparatus, one of them being inhibited by thapsigargin. Bioinformatic studies have predicted this inhibible transporter as the protein HMA1. HMA1 has been previously described as a heavy metal transporter. Heterologous expression experiments have shown that HMA1 can grant Cd™² tolerance and to recover a calcium sensitive phenotype. Transport assays in yeast, show that HMA1 is capable of transporting calcium and moreover, it is inhibible by thapsigargin. This thesis research focused on the development of a system to study HMA1 in Arabidopsis thaliana and its role in the calcium homeostasis, by the silencing ofthe gene that codifies for that protein. Thus, an inducible interference RNA for hmal was designed, generated and cloned, which consisted of 365 bp of the hmal gene in sense direction, followed by the third intron of the actin 11 gene y ended with the same sequence of hmal in the antisense direction. This construct was under control of an incomplete promoter, activated by a transcriptional activator that was codified in the vector. This transcriptional activator was inducible by estradiol. Three A. thaliana lines were transformed with the interference RNA. The first one was the "wildtype", the second one expressed the luminescent protein Aequorin free in the cytosol (Aeqcit) and the third one expressed Aequorin destinated to the Golgi apparatus (Aeqgol). The transformation was probed by PCR for the hygromicin antibiotic resistance gene. Eighteen lines were identified as transformants for the "wildtype", 15 for the Aeqcit line and 15 for the Aeqgol line. Only the "wildtype" transformed line was further analyzed, and it showed that the interference RNA was capable of silencing the hmal gene, after inducing plants for 15 days with estradiol. On the other hand, calcium variations were analyzed in response to an abiotic stimulus. It was observed that after a cold stimulus, cytosolic calcium concentration variations were similar in complete plants and in protoplasts, being a little bit longer in the protoplasts. This variation was characterized by an instantaneous and sudden increase, followed by a gradual decrease until basal levels were achieved. The whole process lasted for about 10 minutes in protoplasts, while in plants it lasted for about 1 minute. The observed calcium variations in the Golgi apparatus agree with the ones observed in plants which are characterized by a differed initial increase (it does not happen in the same instant of the stimulus) followed by a gradual increase, which takes about 10 minutes to reach the maximum level. This characterization will be used to compare the signalling process in hmal-RNAi plants, and determine it's role in calcium homeostasis.