Regulacion de la actividad bactericida de la microcina E492 por los genes de maduración

Abstract

Las bacteriocinas son antibióticos de naturaleza peptídica producidas por una gran variedad de bacterias Gram negativas y positivas, cuyo espectro de acción está restringido a cepas relacionadas con la productora. La microcina E492 (mccE492), es una bacteriocina producida por Klebsiella pneumoniae RCY492, que produce poros en la membrana interna de células sensibles y para su internalización a través de la membrana externa utiliza los receptores de sideróforos tipo catecol Cir Fiu y FeрА. Para la producción de microcina activa sė requiere de un sistema de exportación de tipo ABC y de los genes de maduración mceCIJ. Estudios previos demostraron que la transcripción de los genes de la maduración disminuye en fase estacionaria de crecimiento, y que mutantes en cualquiera de estos genes producen mccE492 en forma inactiva. En esta tesis se estudió la traducción de los genes del sistema productor de mccE492, mediante fusiones traduccionales entre estos genes y el gen reportero lacZ, utilizando el fago transposón Mudll1681. Se determinó que la traducción del gen estructural y de la inmunidad no variaba durante el crecimiento bacteriano, en tanto que la traducción de los genes de exportación y maduración eran mayores en fase exponencial de crecimiento. Se determinó que el aumento en los niveles de traducción de estos genes en fase exponencial depende de la presencia de hierro, situación que sugiere una relación entre la actividad de esta bacteriocina y el metabolismo del hierro. Por otra parte, se encontró que al expresar en S. enterica el sistema de producción de la mccE492 con una mutación en el gen de la maduración mceC se produce mccE492 activa, y que esta microcina presenta las mismas características cromatográficas y electroforéticas que la producida en E. coli. Mediante el clonamiento del gen iroB de S. enterica en E. coli se determinó que este gen puede reemplazar la función de mceC. El gen iroB codifica para una glucosil transferasa implicada en la síntesis de salmoquelina, un derivado glucosilado de la enteroquelina. Para comprobar que la síntesis de salmoquelina es necesaria para la producción de microcina activa se agregó a mutantes en mceC salmoquelina exógena proveniente de sobrenadantes de S. enterica o de E. coli transformada con el gen iroB, así como también con salmoquelinas purificadas correspondientes a enteroquelina monoglucosilada (MGE) y diglucosilada (DGE). La adición de salmoquelina exógena a mutantes en mceC produjo microcina activa. Esta transcomplementación es dependiente de los receptores de catecolatos FepA, Fiu y Cir, pues mutantes en estos genes y тсеC пo transcomplementan con salmoquelina exógena. Además se determinó que las enzimas EntC, EntD y EntF, que participan en la vía de síntesis de enteroquelina son indispensables para la producción de mccE492 activa. Mutantes en EntC y EntD producen mccE492 activa si se adiciona en el medio de cultivo el producto de la reacción que catalizan, pero esto no ocurre en mutantes en EntF. Este resultado sugiere que la actividad de EntF estaría relacionada con la producción de mccE492 en un paso distinto de la sola producción de enteroquelina.

Bacteriocins are antibiotic peptides produced by a great variety of Gram negative and positive bacteria, whose action is restricted to strains related to the producer. Microcin E492 (mccE492) is a pore-forming bacteriocin produced by Klebsiella pneumoniae RCY492, that uses for its internalization the outer membrane catecholate siderophore receptors Cir, Fiu and FepA. The production of active microcin requires genes encoding for an ABC exporter system and for maturation (mceCIJ). Previous studies demonstrated that the transcription of the maturation genes diminished in stationary phase of growth and that mutants in anyone of these genes produced inactive mccE492. In this thesis we studied the translation of the genes present in the mccE492 system. The transposing phage Mudl11681 was used to generate translation fusions between this genes and the reporter gene lacZ. Through this methodology was possible to determine that the translation of the structural and immunity genes do not vary during the bacterial growth, in contrast to the translation of the export and maturation genes that are higher in the exponential phase of growth. The higher translation levels found in the exponential phase of growth depended on the presence of iron, which suggests a relationship between the activity of this bacteriocin and the iron metabolism. On the other hand, we found that when the microcina system with a mutation in the maturation gene mceC was expressed in S. enterica active mccE492 with the same electroforetic and chromatographic characteristics was produced. Cloning of iroB gene of S. enterica in E. coli replaced the function of mceC. IroB encodes for a glucosyl transferase envolved in the synthesis of salmochelin, a glucosylated derivative of enterochelin. In order to verify weather the synthesis of salmochelin is necessary for the production of active microcin, exogenous salmochelin present on supernatants of S. enterica, or E. coli transformed with the gene iroB, or purified salmochelins corresponding to mono-glucosyl enterochelin (MGE) and di-glucosyl enterochelin (DGE) were added to mutants in mceC. The addition of exogenous salmochelin to mceC mutants produced active microcin, and the transcomplementation depended on the catecholates receptors FepA, Fiu and Cir. Mutant in these receptors and mceC were unable to be transcomplemented with exogenous salmochelin. In addition it was determined that the enzymes EntC, EntD and EntF, involved in enterochelin synthesis are necesary for the production of active mccE492. Mutants in EntC and EntD could be complemented by the addition of the product of the reactions in the culture media, but no transcomplementation was observed in EntF mutants. This result suggests that the activity of this enzyme would be related to the production of mccE492 in a step different of enterochelin production.