Caracterización de la bacteria pseudomonas SP. B4 con niveles deficientes de los polifosfatos inorgánicos

Abstract

Los polifosfatos (poliP) son biopolímeros lineales que se han encontrado en todos los seres vivos y están formados por residuos de ortofosfato unidos por enlaces fosfoanhídrido. La importancia de los poliP radica en sus numerosas y. variadas funciones que dependen de su localización (especie, célula o compartimiento celular) y cuándo se necesiten. Los poliPs se sintetizan principalmente a partir de ÁTP por la enzima polifosfato quinasa (PPK) y se degradan a fosfato inorgánico (Pi) por la acción de la exopolifosfatasa (PPX). La regulación de estas dos enzimas es determinante para los niveles de poliP que se encuentren dentro de la célula. La bacteria Pseudomonas sp. B4 es una bacteria degradadora de los contaminantes ambientales policlorobifenilos (PCBs), y es capaz de acumular una gran cantidad de poliP en diferentes condiciones de cultivo. En el laboratorio contamos con dos cepas recombinantes de la bacteria Pseudomonas sp. B4, una con el fenotipo silvestre, y la otra con niveles deficientes en los poliP. Estas cepas permiten realizar estudios comparativos, para estudiar el efecto que tiene la carencia de los poliP en la célula frente a diversas condiciones. Anteriormente se vio que las células en carencia de poliP sufren cambios en la morfología de la colonia, a la vez que se alargan en la fase estacionaria. El objetivo de esta investigación fue estudiar la respuesta diferencial de las dos cepas ante diversas situaciones de estrés como los causados por metales pesados, pH y altas temperaturas. En este Seminario de Título se vio que la presencia del poliP en la célula es importante para la resistencia a los metales pesados como el Cu, Fe y Cd. Sin embargo, esto no sería un fenómeno generalizado para todos los metales, como se vio en el caso del Ni. La presencia de Cu desde el comienzo del crecimiento, fenómeno de adaptación, genera una prolongación de la fase de latencia, que es incluso mayor para la cepa con niveles deficientes de poliP. Además las dos cepas alcanzan densidades ópticas menores en cultivos con Cu. Cuando se agrega Cu a cultivos en activo crecimiento, (shock del metal) ocurre una baja considerable del número de células viables en el cultivo. Posteriormente ocurre una recuperación del título del cultivo, cuya rapidez dependería de los niveles de los poliP en la célula previo al estrés inducido por el metal. Las dos cepas en estudio no mostraron cambios detectables en su crecimiento a diferentes valores de pH. Por otro lado, se realizaron experimentos de estrés por temperatura, demostrando que las cepas con contenido normal de poliP pueden sobrellevar mejor las altas temperaturas. Los resultados de esta investigación apoyan la participación de los poliP como una molécula protectora frente a diversos tipos de estrés, y en particular en la resistencia frente a los metales pesados.

Polyphosphates (polyP) are linear biopolymers that have been found in all living organisms. They are formed from residual orthophosphates connected by phosphoanhydride bonds. The importance of polyP lies in its numerous and varied functions which are dependent upon its location (species, cell or cellular compartment) and under what circumstances it is needed. PolyP is principally synthesized from ATР by polyphosphate kinases (PPKs) and is degraded to inorganic phosphate (Pi) by exopolyphosphatase (PPX). The regulation of the two aforementioned enzymes is a determinant factor for the levels of polyP found in a cell at any given time. The microorganism Pseudomonas sp. B4 is a bacterium with the ability of degrading the environmental contaminants, polychlorobiphenyls (PCBs). It is also able to accumulate a significant amount of polyP under different culture conditions. In our laboratory two recombinant strains of Pseudomonas sp. B4 were studied, one with the wild-type phenotype, and the other with deficient levels of polyP. These strains allowed us to perform comparative studies of the effects on polyP deficiency in cells under а variety of conditions. The aim of this investigation was to find out if the two strains responded in a similar manner when faced with diverse situations of stress represented by heavy metals, pH variation, and high temperatures. In this work it was shown that the presence of polyP in the cell is important for its resistance to heavy metals studies, Cu, Fe and Cd. However, this was not a generalized phenomenon for all heavy metals, as illustrated by the results obtained with Ni. The presence of Cu in the culture from the beginning of growth, as an adaptive phenomenon, caused a delay in the lag phase. This lag phase was more extended in the strains lacking polyP. Both strains reached lower optical densities in cultures in the presence of Cu, compared to those grown in the absence of Cu. When cultures previously grown in the absence of Cu were faced with this metal, a considerable loss of viable cells was seen in the culture. This was followed by a recovery whose speed was dependent on the levels of polyP existing in the cell previous to the stress induced by the metal. The two Pseudomonas sp. B4 strains used in this study showed no detectable changes in their growth in response to different levels of pH. On the other hand, cells subjected to higher temperatures showed that strains containing normal levels of polyP better overcome these conditions of stress. The results of this investigation support the hypothesis for the role of polyP as a molecule capable of protecting the cells from diverse types of stress, and in particular the resistance to heavy metals.