Optimización del cultivo in vitro de Azorella trifucata para la obtención de diterpenos con propiedades medicinales

Abstract

Las plantas del género Azorella, entre ellas A. compacta y A. trifurcata, han sido investigadas por mucho tiempo debido a sus conocidas cualidades medicinales, las cuales se han estudiado en profundidad y se ha encontrado que están asociadas a la acción de compuestos llamados diterpenos los cuales poseen estructuras orgánicas muy particulares encontradas en este tipo de plantas y que les confieren las cualidades medicinales respectivas. Dentro de los caracteres medicinales que estos diterpenos poseen están sus actividades antihiperglicémicas, combatientes del Aizheimer, antiparasitarias, gastroprotectoras, espermicidas, antibacterianas, antiinflamatorias, entre otras. De aquí se desprende el interés de desarrollar métodos alternativos de producción de este tipo de compuestos desde el punto de vista biotecnológico, ya que estas plantas son especies protegidas y su explotación con fines farmacológicos no puede ser realizada, además de que presentan un crecimiento muy lento como para realizar cultivos de estas al nivel de otras especies de común uso en la agricultura. Dentro de los métodos que se han buscado para realizar la producción de metabolitos secundarios con actividad biológica en plantas del género Azorella, recientemente se han desarrollado cultivos líquidos de células en suspensión de A. compacta, las cuales se producen básicamente estimulando explantes de la planta en oscuridad con la hormona sintética 2,4D (ácido diclorofenoxiacético) para así generar callos los cuales son puestos luego en medio líquido con la hormona en donde son producidas las células en suspensión. Esta aproximación experimental fue replicada en este seminario de título con células de Azorella trifurcata. Adicionalmente, se estimularon las células mediante el uso de elicitores como lo son el ácido jasmónico o el ácido salicílico, los cuales poseen la capacidad de estimular células para producir metabolitos secundarios que están asociados a la defensa de la planta contra estrés abiótico o biótico. De esta manera se encontró mediante TLC (cromatografía en capa fina) que mediante tratamientos con ácido jasmónico se produjeron compuestos orgánicos de tipo apolar. Por otro lado, como no se conocen las rutas de biosíntesis de diterpenos en plantas de este género, se intentó realizar un análisis de expresión de genes conocidos que generan diterpenos cíclicos en otras plantas relativamente cercanas a Azorella confeccionando partidores específicos para los genes ent-kaureno sintasa y pirofosfato de ent-copalilo sintasa que codifican para enzimas involucradas en la síntesis de diterpenos. Luego de obtener un amplificado de PCR candidato, éste se clonó en bacterias y se envió a secuenciar, el cual fue obtenido utilizando los partidores elaborados para ent-kaureno sintasa, en donde se produjo una secuencia de 660 pb la cual, desafortunadamente, correspondió al gen de la subunidad ribosomal 26S de Azorella trifurcata.

Plants of the genus Azorella, among them A. compacta and A. trifurcata, have been investigated for a long time because of its known medicinal qualities, which have thoroughly been studied and it has been found that these medicinal qualities are associated to the action of compounds called diterpenes which have very particular organic structures in these plants, structures that give them the respective medicinal qualities. Within these qualities, there are diterpenes with biological activities such like antihyperglicemic, Alzheimer fighters, antiparasitic, gastroprotective, spermicides, antibacterial, anti-inflammatory, among others. Because of this, it has been attracted the interest on developing alternative methods of production of these compounds from the point of view of biotechnology, as these plants are protected species and their exploitation for pharmacological purposes cannot be performed, in addition to having a very slow growth rate compared to other species commonly used in agriculture. Within the methods for the production of biological active secondary metabolites, in plants of the genus Azorella recently it has been tried to generate models of liquid cultures of cells in suspension in A. compacta, which are produced mainly by stimulating explants of the plant in darkness with the synthetic hormone 2,4D (dichlorophenoxyacetic acid) to generate calli which are then placed in liquid medium with the hormone, thus producing the cells in suspension. These experiments were replicated in this thesis with Azorella trifurcata cells. Additionally the cells were stimulated using elicitors such as jasmonic acid or salicylic acid, where it has been shown that this elicitors have the ability to stimulate cells to produce secondary metabolites that are associated with plant defense against biotic or abiotic stress. Thus, possible diterpene biosynthesis was studied in liquid cultures which were analyzed by TLC (thin layer chromatography) and it was found that by using jasmonic acid, polar organic compounds were produced. Furthermore, as routes of biosynthesis of diterpenes in plants of this sort are not known, it was attempted expression analysis of known genes that generate cyclic diterpenes in other nearby plants to Azorella making specific primers for the genes ent-kaurene synthase and ent-copalyl pyrophosphate synthase, then it was obtained a candidate DNA fragment amplified by the PCR technique using primers made to the ent-kaurene synthase gene, which was cloned into bacteria and sent to sequence. Unfortunately the sequence corresponded to the 26S ribosomal subunit gene of Azorella trifurcata.