Caracterización de la homeostásis de hierro en células CACo-2 expuestas a hierro hemínico y que sobreexpresan la enzima hemoxigenasa 1

Abstract

Las células del epitelio intestinal son el principal sitio de absorción de hierro (Fe) dietario, el cual puede ser captado como Fe-hem (Fe contenido en el grupo hem de hemoproteínas) o Fe inorgánico. El Fe-hem constituye la fuente de Fe más biodisponible, ya que no necesita de factores luminales para su absorción. La captación de ambas fuentes de Fe ocurre por vias independientes; mientras que el Fe inorgánico ingresa a la célula a través de DMT1, el Fe-hem es captado a través de HCP1, que presumiblemente realiza un transporte transmembrana de la molécula. Una vez en el interior de la célula el Fe-hem es degradado por HO1, liberando Fe, CO y biliverdina, la cual es rápidamente reducida a bilirrubina. HO1 es inducible por numerosos estímulos que comparten la característica de poseer propiedades prooxidantes, entre ellos su sustrato el Fe-hem, y se ha visto que esta inducción confiere protección a las células frente al estrés oxidativo. Se ha atribuido esta protección a los productos de la degradación del Fe-hem, ya que CO posee propiedades antiinflamatorias y anti-apoptóticas, la bilirrubina actúa como antioxidante y el Fe liberado es capaz de inducir la expresión de Ferritina, de manera que se previene el potencial daño oxidativo que puede producir el Fe libre. Sin embargo, estudios en ratones knockout para la proteína han sugerido un mecanismo adicional de protección mediado por HO1, en el cual ésta promueve la salida de Fe, evitando así un aumento en los niveles intracelulares de Fe. Con la hipótesis de que la sobreexpresión de HO1 aumenta la salida de Fe a través de la membrana basolateral de células intestinales, en este trabajo hemos generado una línea estable de células tipo epitelio intestinal Caco-2 que sobreexpresan HO1 y hemos encontrado que estas células presentan un marcado aumento tanto en la captación como en la salida de Fe al ser incubadas con Fe-hem, sin embargo no se observa el mismo efecto al ser incubadas con Fe inorgánico. Además observamos una mayor tasa de salida de la molécula de Fe-hem en células control en comparación a células transfectadas con el cDNA de HO1. Por otro lado, hemos caracterizado el efecto de la exposición de células Caco-2 silvestres a Fe-hem. Encontramos que esta exposición induce un aumento en los niveles intracelulares de Fe y en la expresión de HO1 y la proteína de almacenaje Ferritina. Sin embargo, no se observó un cambio significativo en la expresión de DMT1 e Ireg1. Estos resultados difieren a lo visto en células Caco-2 expuestas a Fe inorgánico, en que una mayor concentración intracelular de Fe disminuye la actividad de IRPs, lo cual resulta en la producción de proteínas involucradas en el almacenamiento de Fe y disminución en las proteínas involucradas en la captación. Sugerimos, por lo tanto, que el Fe-hem no es capaz de modular la actividad de IRPs como el Fe inorgánico y probablemente no forme parte del pool común de Fe intracelular junto al Fe captado en forma inorgánica, sino que sigue otro destino intracelular. No observamos cambios en la expresión del exportador Ireg-1, por lo que el aumento en la salida de Fe no podría explicarse por un aumento en la expresión del exportador. Estudios de localización subcelular de HO1 frente a un estímulo de Fe-hem indican un cambio desde una localización perinuclear, asociada al retículo endoplasmático, hacia la membrana plasmática en esta condición, donde co-localiza parcialmente con Ireg-1. Ensayos de biotinilación muestran la presencia de HO1 tanto en la membrana apical, donde podría cumplir una función en la captación de Fe-hem, como en la membrana basolateral.

Intestinal epithelial cells are the main site of iron (Fe) absorption. Fe can be absorbed as Heme-Fe (Fe found in the heme group of hemeproteins) or as inorganic Fe. Heme-Fe is the most bioavailable form of Fe, for it doesn't need lumimal factors for its absorption. Uptake of both Fe sources occurs by independent pathways; while inorganic Fe enters the intestinal cell through the transporter DMT1, heme-Fe uptake takes place through the recently identifyed heme transporter HCP1, which presumably carries out a transmembrane transport of the molecule. Once inside the cell, the degradation of heme-Fe is catalyzed by HO1, which releases the Fe, CO and biliverdin. HO1 can be rapidly induced by a variety of stimulus that share prooxidant properties, among them its natural substrate, heme-Fe. It has been reported that HO1 induction confers cytoprotection to several cell types against oxidative stress, and this effect has been attributed to the by-products of heme catalysis. CO has been shown to have anti-inflammatory and anti-apoptotic properties, biliverdin is rapidly transformed into bilirrubin, which has an anti-oxidant effect, and free Fe is thought to induce Ferritin expression. However, studies in knockout mice lacking HO1 function have revealed an additional role for the protein, promoting Fe extrusion from tissues, avoiding this way an increase in intracellular Fe content. With the hypothesis that HO1 overexpression increases Fe efflux through the basolateral membrane of intestinal cells, we generated a Caco-2 stable cell line that overexpresses HO1, and found that these cells show increased heme-Fe uptake and Fe efflux when incubated with heme-Fe. We did not see the same effect when cells were exposed to an inorganic Fe source. Furthermore, we report a decreased hemeFe extrusion through the basolateral membrane of cells transfected with HO1 cDNA compared to control cells. Furthermore, we characterized the effect of heme-Fe exposure on Fe homeostasis proteins in wild type Caco-2 сells. We observed that this exposure induced increased expression of HO1 and the storage protein Ferritin. However, we did not see a significant change in the expression of DMT1 and Ireg1. These results differ from what has been described for Caco-2 cells exposed to inorganic Fe sources, where an increase in intracellular Fe concentration induces a decrease in IRP proteins activity, leading to an upregulation of proteins involved in Fe storage and a downregulation of proteins involved in its uptake. Therefore, we suggest that hemeFe is not able to regulate IRPs activity as inorganic Fe does, and probably does not become part of a common pool of intracellular iron with Fe derived from inorganic sources. We did not observe a change in the expression of the Fe exporter Ireg-1, therefore we believe that the increase in Fe release cannot be explained by an increase in any transporter available for this process. Subcellular localization studies of HO1 protein in cells exposed to heme-Fe indicate a change from a perinuclear, endoplasmic reticulum-associated location towards the plasmatic membrane, where it partially co-localizes with Ireg-1. Biotinylation studies reveal the presence of the protein in the apical membrane, where it could play a role in heme-Fe uptake, and also in the basolateral membrane.