Nanopartículas de oro conjugadas a reptidos para el desarrollo de una nueva estrategia terapeútica para la enfermedad de Alzheimer

Abstract

Varias son las patologías producidas por el mal plegamientos y la posterior agregación de proteínas, produciendo especies tóxicas. En la actualidad no existe un tratamiento efectivo para combatir este tipo de enfermedades, por lo que en nuestro laboratorio se está desarrollando una novedosa estrategia terapéutica que se basa en el uso de nanotecnología. Es posible conjugar nanopartículas de oro (AuNP) a diversos péptidos que poseen afinidad por estos agregados tóxicos y dirigirlos específicamente donde estos se encuentren, asi se podría realizar una especie de "Cirugía molecular", basada en la excitación de estas AuNP por parte de un Campo magnético oscilante, lo cual produce la liberación de energía por parte de estas nanopartículas permitiendo la desagregación de estos complejos proteicos, convirtiéndolos en especies menos tóxicas. En el caso específico de la presente memoria de título, ésta se enfoca en una etapa inicial del proyecto, donde se pretende determinar la estabilidad de distintos conjugados AuNPpéptido marcados fluorescentemente y la capacidad que presentan para unirse selectivamente a los agregados tóxicos de la proteína ẞ-amiloide (Aß) involucrada en la enfermedad de Alzheimer. El uso de estos conjugados marcados fluorescentemente facilitan los estudios in vivo de biodistribución y paso a través de la barrera hemato encefálica (BHE), los cuales fueron realizados de forma preliminar en este trabajo. Por lo tanto, se sintetizaron AuNP de 10 nm de diámetro mediante la reducción de ácido tetracloroáurico (HAuCl4) con citrato de sodio dihidratado y se conjugaron al péptido CLPFFDNH2 (Inh), el cual es una modificación del péptido disruptor de laminas B LPFFDNH2 que posee afinidad por los agregados de Aß. También fueron utilizados 2 isomeros de este Inh, para evaluar si esta interacción es secuencia dependiente. Estos conjugados fueron marcados con Rodamina B o con Carboxifluoresceína, por lo que se estudiaron un total de seis conjugados. La totalidad de los conjugados presentaron especificidad por las fibras Aß, lo cual nos da pie para utilizar estos conjugados en futuros estudios ex vivo e in vivo. En relación a los estudios de biodistribucion y paso a través de la BHE, estos se realizaron a partir de la inyección tanto del conjugado AuNP-Inh, marcado con Rodamina B, en ratas como del AUNP-CY, marcado con 1125 a nivel de la Tirosina, en ratones. En ambos casos se observo una gran acumulación de nanoparticulas en el hígado y en menor medida en el cerebro, sin embargo lo suficiente para concluir que estas nanopartículas son capaces de cruzar la BHE. Sin lugar a duda se deben seguir realizando estudios de biodistribución, sin embargo los resultados obtenidos en este aspecto son muy prometedores para el desarrollo de este proyecto.

Several pathologies produced by the misfolding and later aggregation of proteins, producing toxic species. Presently an effective treatment does not exist to treat these diseases. In our laboratory we are developing a novel therapeutic strategy, based on the use of nanotechnology. Gold nanoparticles (AuNP) coated with peptides with high affinity for toxic protein deposits that triggers these diseases, and could be targeted specifically to these aggregates and give rise to a local "molecular surgery", based on the excitation of these AuNPs produced by a magnetic oscillating field. When these nanoparticles are excited, they release enough energy that allows the disaggregation of these protein complexes, turning them into less toxic species. Thus, this thesis is framed as the first stage and is being pursue to obtain stable AuNP-Peptide conjugates labeled with a fluorophore able to selectively attach to the toxic deposits of the amyloid ẞ protein (AB) involved in Alzheimer's disease. The use of these conjugates labeled with a fluorophoro, makes the in vivo studies easier for biodistribution and permeability of the Blood Brain Barrier (BBB). Therefore, AuNPs of 10 nm of diameter were synthesized by means of the reduction of acid tetracluoroauric (HAuC4) with citrate of sodium dehydrated. They were conjugated to the peptide CLPFFDNH2 (Inh), which is a modification of the ẞ-sheet breaker LPFFDNH2 that possesses affinity for the Aß aggregates. Also we used 2 isomerics of this Inh. To evaluate if this interaction is a sequence dependent these conjugates were labeled with Rodhamine B and Carboxifluoresceine, and six conjugates were studied. All the conjugates presented affinity for the Aß fibrils, which allows us to use these conjugate in future ex vivo and in vivo studies. In relation to the studies of biodistribution and permeability of the BBB, these were carried out by means of the injection of the conjugate AuNP-Inh-Rod in rats and by injection of AuNP-CYI125 in mice. In both cases a great accumulation of nanoparticles in the liver and some in the brain have been observed. Nevertheless, it is sufficient to conclude that these nanopartícles are capable of crossing the BBB.