Efecto del frio en la movilidad y producción de biopelícula de diferentes cepas de Listeria monocytogenes

Abstract

Listeria monocytogenes es una bacteria Gram positiva, ubicua, psicrótrofa, causante de listeriosis, que forma biopelículas en diferentes superficies que se encuentran en la industria de alimentos. En el proceso de formación de biopelículas la presencia de flagelo ha sido vinculada con la capacidad de adherencia a superficies y su ausencia se traduce, en algunas cepas, en una reducción de la formación de biopelículas. En un trabajo publicado por nuestro grupo, se analizó el perfil de expresión global de cepas de L. monocytogenes con distinta velocidad de proliferación a 8°C, describiendo una represión de genes flagelares en aquellas cepas de rápida proliferación. Dada esta diferencia de expresión de genes flagelares y al vínculo que existe entre la presencia de flagelo y formación de biopelícula, es que se planteó la siguiente hipótesis: "Aislados de Listeria monocytogenes con distintas velocidades de proliferación en frio presentan capacidades diferenciales de movilidad y formación de biopelícula que se relacionan con los niveles de expresión de los genes relacionados a estas funciones en respuesta a la baja temperatura". Para llevar a cabo esta investigación, se utilizaron 8 cepas de L. monocytogenes (4 de rápida y 4 de lenta proliferación en frío) que fueron tipificadas genéticamente mediante PFGE. Se evaluó la movilidad de estas cepas en frío, utilizando medios semisólidos. Las cepas de proliferación lenta, resultaron ser significativamente más móviles que las cepas rápidas. Posteriormente se evaluó su capacidad de adherencia a superficies de acero a 8°C pasadas 24 horas. Se observó que la capacidad de adherencia es independiente de la velocidad de proliferación en frío. Luego se evaluó la capacidad de formar biopelículas en acero y vidrio durante 24 días. Las cepas rápidas presentaron una mayor producción de biopelícula al sexto día de incubación en ambas superficies, mientras que las cepas lentas variaron su máxima producción entre el sexto y el decimoctavo día de incubación. Finalmente se realizó un análisis de los niveles de expresión génica de los genes asociados a la formación de biopelículas, incluyendo genes de "quorum sensing" (agrD y agrB), genes flagelares (flgD y motB), un gen de quimiotaxis (cheR) y genes reguladores (mogR y gmaR). Estos fueron evaluados durante las primeras 24 horas de exposición a frío y luego a las 96 horas. El conjunto de genes estudiados presentó niveles de expresión que resultó ser equivalente entre las cepas de clasificación rápida y lenta durante las primeras 24 horas, sin embargo, estos niveles de expresión se diferenciaron a las 96 horas de incubación resultando en una represión de los genes nombrados en las cepas rápidas y una ligera sobreexpresión en las cepas lentas. Estos niveles de expresión fueron vinculados a la función del inhibidor GmaR, el cual inhibe la acción del regulador transcripcional MogR, dado que el gen gmaR presenta mayores niveles de expresión en las cepas de proliferación lenta, que en las cepas rápidas, lo que se traduce en una mayor inhibición de MogR, resultando en una mayor expresión de genes flagelares. A modo de conclusión, en este trabajo se observó que en cepas de L. monocytogenes existe una relación inversa entre la velocidad de proliferación y movilidad a 8°C; todas las cepas fueron capaces de formar biopelículas en superficies de vidrio y de acero de forma independiente a su velocidad de proliferación en frío; y la represión del gen gmaR en cepas de L. monocytogenes de proliferación rápida en frío, favorece la represión de genes flagelares a 8°C.

Listeria monocytogenes is a Gram positive, ubiquitous, psychrotrophic bacterium, and it is the cause of Listeriosis. This pathogen is able to form biofilm on different surfaces that are commonly used in the food industry. L. monocytogenes flagella has been linked to the bacterium ability to adhere to surfaces during biofilm formation, and its absence results in a decrease of the biofilm formation in some strains. Previously, our group analysed the global gene expression profile of L. monocytogenes displaying different proliferation rates at 8°C. We concluded that "fast" growing strains repressed flagellar genes at 8°C. Given the difference in the flagellar gene expression pattern and the link between the presence of flagella and biofilm formation, is that we proposed the following hypothesis: "Isolates of Listeria monocytogenes that display different proliferation rates at cold temperatures show differential motility and biofilmforming ability which is related to flagellar gene expression levels at low temperatures". We used 8 L. monocytogenes strains (4 fast and 4 slow proliferation strains at 8°C) which where genetically typified using PFGE. Strain motility was evaluated using semi-solid agar plates. The slow proliferating strains were significantly more motile than the fast proliferating strains. Then, we evaluated the surface adhesion ability of these bacteria at 8°C after 24 hours of incubation. We observed that the adhesion ability was unrelated to the proliferation rate at low temperatures. After that, we evaluated the bacterial biofilm-forming ability on stainless steel and glass surfaces over 24 days. The fast proliferating strains showed a higher biofilm production on the sixth day of incubation on both surfaces. Conversely, slow proliferating strains showed different biofilm-forming peak days, which varied between the sixth and the eighteenth day of incubation. Finally, we analyzed the gene expression levels of those genes linked to biofilm production, including quorum sensing genes (agrD and agrB), flagellar genes (flgD and motB), one chemotaxis gen (cheR) and regulatory genes (mogR and gmaR). These genes were evaluated during the first 24 and after 96 hours of cold exposure. The studied set of genes showed similar gene expression levels among the fast and the slow proliferating strains during the first 24 hours of cold exposure; however, gene expression levels differed after 96 hours of incubation resulting in a repression of the entire set of genes in the fast proliferating group and a slight overexpression in the slow growth group. The gene expression levels described were related to the function of the protein inhibitor GmaR, which inhibits the transcriptional regulator MogR. Since gmaR showed higher expression levels in the slow proliferating strains than in the fast proliferating group, a higher MogR inhibition would result in higher expression levels of flagellar genes. In conclusion, we observed that L. monocytogenes showed an inverse relationship between proliferation rate and motility at 8°C. Also, all the strains were capable of producing biofilm on glass and stainless steel independently of their proliferation rate in cold. Finally, repression of the gene gmaR on fast-proliferating strains of L. monocytogenes helped to repress flagellar genes at 8°C.