Identificación de epítopos y regiones inmunodominantes en proteínas virales de hantavirus andes

Abstract

El síndrome cardiopulmonar por hantavirus (SCPH) causado por la infección por hantavirus Andes (ANDV), es una enfermedad infecciosa endémica en Chile y Argentina. Existe evidencia que linfocitos T específicos contra hantavirus participan en la protección inmune independiente del título de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo a la fecha no se han descrito en la literatura estudios que describan en humanos la respuesta inmune celular contra ANDV. El objetivo de la presente tesis fue detectar y cuantificar linfocitos T específicos contra ANDV y determinar el o los epítopos inmunodominantes por medio de estimulación de PBMC de 75 pacientes convalecientes de la infección con ANDV (entre 4 y 159 meses después de la infección). En ensayos de ELISPOT para IFN-y se estimularon PBMC con 310 péptidos de 15 aminoácidos traslapados que representan las secuencias completas de las proteínas de la Nucleocápside (N) y del precursor de las Glicoproteínas (G1 y G2) de ANDV. Luego para determinar las regiones y epítopos inmunodominantes las PBMC de los pacientes se estimularon con péptidos individuales en ensayos de ELISPOT. En 47 de los 75 pacientes estudiados (63%) se detectaron linfocitos T de memoria secretores de IFN-y específicos contra ANDV. Dentro de este grupo el extremo carboxilo terminal de la proteína G1 fue la región más inmunodominante ya que 22 (47%) de los pacientes exhibieron una respuesta positiva con un promedio de 622 linfocitos T/ 109 PBMC. Se pudo demostrar que dentro de la región carboxiterminal que el epítopo G1466- 472 fue reconocido solamente por pacientes que expresaban el alelo HLA-B*35. Cabe hacer notar que solo la respuesta inmune de linfocitos T contra G1 pero no contra N ni contra G2 fueron detectados hasta más de 13 años después de la infección aguda con ANDV. Además se identificaron epítopos en la proteína N, así como epítopos adicionales en G1. La presente tesis corresponde al primer trabajo en que se muestra en pacientes la respuesta inmune celular contra la infección con ANDV. En contraposición con lo que se ha descrito para otros hantavirus, la proteína G1 constituye un antígeno altamente inmunogénico. Por lo tanto G1 podría ser un excelente candidato para una vacuna que induzca inmunidad celular a largo plazo contra la infección con ANDV. No obstante, dado que el alelo HLA-B*35 se expresa en un 25% de la población residente en la región endémica, se requieren estudios adicionales para determinar la restricción a HLA de otros epítopos en G1. Adicionalmente, nuestros datos forman la base para realizar estudios futuros con tetrámeros de MHC clase I para estudiar la función y el fenotipo de los linfocitos T específicos contra ANDV durante la fase aguda de la infección. Esto ayudaría a comprender mejor la patogénesis de la infección permitiendo así el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.

Hantavirus Cardiopulmonary Syndrome (HCPS) due to Andes hantavirus (ANDV) is an emerging infectious disease endemic to Chile and Argentina. There is evidence that hantavirus-specific T-cells can mediate protective immunity independently of neutralizing antibodies. However, up to date, there are no data available on the human T cell response to ANDV infection, the immunodominant regions and epitopes of ANDVspecific T cells. The objective of this thesis was to detect and enumerate ANDV-specific T-cells and to determine the immunodominant epitope(s) by stimulation of PBMC from 75 convalescent ANDV patients (4-159 months post hospitalization).Therefore, PBMC were stimulated in in vitro IFN-y ELISPOT assays using a panel of 310 overlapping 15mer peptides which span the entire (N)ucleocapsid- and (G)lyco-(G1 and G2) protein of ANDV. Subsequently, determination of immunodominant regions and epitope mapping was performed by stimulation of cryoperserved PBMC with individual peptides in ELISPOT assays. Among all patients, 47 (63%) showed circulating, ANDV-specific memory T-cells. Among these patients, the carboxy-terminus of G1 was by far the most immunodominant region with 22 (47%) patients scoring positive with a mean response of 622 T lymphocytes/106 PBMC. Through this thesis we were able to demonstrate that the epitope G1466-472 contained within the carboxyterminal region of G1 protein, was recognized exclusively by HLA-B*35* patients. Interestingly, the G1-, but not N- or G2-, specific T-cell responses were maintained over time, for up to 13 years after acute infection with ANDV. Additional G1-specific as well as N-specific T-cell epitopes were identified. This thesis constitutes the first report on human cellular immune responses towards the emerging infection with ANDV. In contrast to what is described for other hantaviruses, the G1-protein represents a highly immunogenic antigen. Thus, G1 might be an excellent candidate for a vaccine inducing long-term cellular immunity towards ANDV. And yet, given that 25% of the population living in the endemic region of ANDV express the HLA-B*3501 allele, additional studies are necessary to determine the HLA-restriction of further G1-epitopes. Additionally, our data will allow the synthesis of MHC class I tetramers in order to determine the function and phenotype of ANDV specific T cells during the acute phase of infection. This would broaden our understanding of the pathogenesis of ANDV infection and thereby allow the development of new treatment strategies.