Adaptaciones de arqueas hipertermófilas a ambientes de altas temperaturas:estudios de estabilidad térmica y mecanismo cinético en quinasas dependientes de ADP

Abstract

Los organismos extremófilos son aquellos que viven en ambientes considerados como extremos. En general, la mayoría de estos microorganismos pertenecen al dominio celular de las arqueas. Uno de los grupos más estudiados de arqueas es el de los thermococcales, en particular la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus. Una de las características más interesantes de este orden es que el flujo glicolítico procede a través de una versión modificada de la vía de Embden-Meyerhof, donde las actividades glucoquinasa y fosfofructoquinasa son dependientes de ADP en vez de ATP. Estas quinasas son homólogas entre sí y estudios estructurales han mostrado que pertenecen a la superfamilia riboquinasa. En este trabajo se estudiaron algunas características cinéticas, aspectos de la regulación de la actividad, estabilidad y estructura de dos quinasas de la familia ADP-dependiente, la glucoquinasa dependiente de ADP de Thermococcus litoralis y la fosfofructoquinasa dependiente de ADP de Pyrococcus horikoshii, con el fin de comprender las bases de su adaptación a ambientes de alta temperatura. Los resultados mostraron que ambas enzimas presentan cinéticas de saturación hiperbólicas para ambos sustratos. Además, sugieren que ambas enzimas presentan un mecanismo al azar de adición de sustratos. Se estudió la estabilidad de la glucoquinasa de T. litoralis mediante desplegamiento inducido por cloruro de guanidinio y estudios de la dependencia de la velocidad de desplegamiento con la temperatura. Se observó que el proceso de desplegamiento es extremadamente lento a todas las temperaturas ensayadas debido principalmente a una barrera energética de activación de tipo entálpico. Se determinó que para el plegamiento tipo-riboquinasa existe una correlación significativa entre la cantidad de residuos ionizables y la temperatura de crecimiento óptimo de los organismos a los que estas proteínas pertenecen, principalmente debido a un aumento de residuos glutámicos y argininas en las proteínas termófilas. También, se encontró una correlación entre la cantidad de residuos aromáticos y la temperatura de crecimiento óptimo, principalmente debido a un aumento de las fenilalaninas en las proteínas termófilas. Una correlación más débil se observó con los puentes salinos. Los datos sugieren una contribución importante del fortalecimiento de las interacciones hidrofóbicas y de las interacciones electrostáticas de largo alcance a la estabilidad. Tanto cisteinas, histidinas como glutaminas disminuyen en las proteínas termófilas en comparación con las proteínas mesófilas.

The extremophilic organisms are those who live in environments considered as extremes. In general, most of them belong to the archaea cellular domain. The thermococcales are one of the most studied groups of the archaea domain, in particular the hyperthermophilic archeon Pyrococcus furiosus. One of the most interesting features of this group is that the glycolytic flux proceeds through a modified version of the Embden-Meyerhof pathway, where the glucokinase and phosphofructokinase activities are ADP-dependent instead of ATP-dependent. These kinases are homologous to each other and structural studies have shown that they belong to the ribokinase superfamily. In this work we studied some kinetic characteristics, regulatory aspects of the activity, stability and structural features of two kinases of the ADP dependent family, of the ADP-dependent glucokinase from Thermococcus litoralis and the ADP-dependent phosphofructokinase from Pyrococcus horikoshii, in order to gain knowledge of the basis of their adaptations to extreme temperature environments. The results showed that both enzymes present hyperbolic kinetic saturations for both substrates. The stability of the glucokinase from T. litoralis was studied by using guanidinium hydrochloride induced unfolding together with the dependence of the unfolding kinetics with temperature. It was observed that the unfolding process is extremely slow at all the temperatures used due to an enthalpic activation energy barrier. It was determined that, for the ribokinase-like fold, exists a significant correlation between the number of ionizable residues and the optimal growth temperature of the organisms to these proteins belong, mainly due to an increase of glutamic and arginine residues in the thermophilic proteins. Also, it was found a significant correlation between the number of aromatic residues and the optimal growth temperature, which is due to an increase of the phenylalanine residues in the thermophilic proteins. A slighter correlation was seen with salt bridges. The results suggest a relevant contribution of the strengthening of the hydrophobic interaction along with long range electrostatic interactions to the stability. Cysteine, histidine and glutamine residues decrease in the thermophilic proteins compared to the mesophilic ones.