Desarrollo de una herramienta informática para la clasificación y anotación funcional de islas genómicas asociadas a genes de tRNAs y tmRNAs en el género Klebsiella

Abstract

La aparición de nuevas cepas microbianas resistentes a múltiples antibióticos junto a cepas hipervirulentas harán progresivamente más difícil el tratamiento de las infecciones, lo que constituye una de las principales amenazas a la salud mundial. Además, se conoce que la aparición de resistencia está estrechamente asociada al uso de antibióticos y esto ha ido en aumento durante las últimas décadas debido al uso en alta cantidad y en indicaciones inadecuadas en humanos y en otros animales. Unos de los microorganismos principales en esta amenaza son las bacterias integrantes del género Klebsiella, las cuales destacan por acceder a un grupo movilizable de genes de virulencia y por ser un reservorio de genes de resistencia antibiótica, los cuales podrían diseminarse a otras especies gramnegativas, posibilitando la aparición de nuevas cepas que combinen multirresistencia e hipervirulencia. La transferencia genética horizontal ha tenido un rol central en este proceso porque permite intercambiar una amplia variedad de genes. Los elementos genéticos móviles (MGE) son quienes permiten esta transferencia y, dentro de ellos, están las islas genómicas (GIs) que son un grupo importante, pero poco estudiado. Existe evidencia de que las GIs tienen un papel importante en la evolución y patogénesis de K. pneumoniae, por esto, se ha hecho necesario sistematizar y automatizar su estudio. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una herramienta bioinformática para comparar, clasificar y anotar GIs asociadas a genes de tRNAs y tmRNAs de cepas del género Klebsiella. Para evaluar los resultados de esta herramienta se utilizaron GIs que previamente habían sido analizadas en detalle y publicadas por este y otros grupos de investigación. En un primer paso, esta herramienta es capaz de agrupar las GIs y generar un conjunto no redundante de islas que permite realizar el análisis en un menor tiempo y con un menor procesamiento computacional. Posteriormente, la herramienta utiliza diversas bases de datos para anotar los genes predichos en cada una de las GIs e identificar regiones asociadas a clústeres biosintéticos y fagos integrados gracias al uso de varios programas bioinformáticos. Con la herramienta funcionando correctamente, se procesó un conjunto ampliado de 1.004 cepas que, hasta ahora, no ha sido analizado. En este conjunto se identificaron 7.648 GIs, generándose un conjunto no redundante de 2.411 islas donde se identificaron 79.293 CDS. La anotación identificó 666 genes de integrasas, 822 de toxinas y antitoxinas, 8.221 factores de virulencia, 1.295 genes relacionados con resistencia a antibióticos y 2.954 genes relacionados con biocidas antibacterianos y resistencias a metales. En la identificación de regiones, se reconocieron 358 profagos y 107 clústeres biosintéticos. En un paso posterior se anotaron funcionalmente otros 29.898 CDS, quedando sin identificar 16.464 proteínas hipotéticas. Un análisis bioinformático como este es un buen punto de partida para analizar GIs desconocidas porque, en poco tiempo y con pocos recursos computacionales, anota los genes codificados en ellas y permite guiar el análisis para centrarse en estudios posteriores. En el futuro, con información más completa en las bases de datos, esta misma herramienta podrá tener mejores resultados.

The emergence of new microbial strains with resistance to multiple antibiotics combined to hypervirulent strains will make progressively more difficult to treat infections, which is one of the main threats to global health. Furthermore, the emergence of resistance is known to be closely associated with the use of antibiotics and this has been increasing over the last decades due to high usage and inappropriate indications in humans and other animals. One of the main microorganisms in this threat are bacteria belonging to the genus Klebsiella, which stand out for accessing a mobilizable pool of virulence genes and for being a reservoir of antibiotic resistance genes, which could spread to other gram-negative species, enabling the emergence of new strains combining multi-resistance and hypervirulence. Horizontal gene transfer has played a central role in this process because it allows a wide variety of genes to be exchanged. Mobile genetic elements (MGEs) are those that allow this transfer and, among them, there are genomic islands (GIs), which are an important but poorly studied group. There is evidence that GIs play an important role in the evolution and pathogenesis of K. pneumoniae, therefore, it has become necessary to systematize and automate their study. The aim of this work was to develop a bioinformatics tool to compare, classify and annotate GIs associated with tRNAs and tmRNAs genes of Klebsiella strains. GIs that had previously been analysed in detail and published by this and other research groups were used to evaluate the results of this tool. In a first step, this tool clusters the GIs and generates a non-redundant set of islands that allows the analysis to be performed in a shorter time and requires less computational processing. Subsequently, the tool uses various databases to annotate the predicted genes in each of the GIs and identifies regions associated with biosynthetic clusters and integrated phages using bioinformatics software. With the tool working properly, an expanded set of 1,004 strains was processed, which has not been analysed so far. In this set, 7,648 GIs were identified, generating a non-redundant set of 2,411 islands where 79,293 CDS were identified. The annotation identified 666 integrase genes, 822 toxin and antitoxin genes, 8,221 virulence factors, 1,295 antibiotic resistance-related genes and 2,954 genes related to antibacterial biocides and metal resistances. In region identification, 358 prophages and 107 biosynthetic clusters were recognized. In a subsequent step, a further 29,898 CDS were functionally annotated, leaving 16,464 hypothetical proteins unidentified. A bioinformatics analysis like this is a useful starting point to analyse unknown GIs because, in a shorter time and with fewer computational resources, it annotates the encoded genes and allows guiding the analysis to focus on further studies. In the future, with more comprehensive information in the databases, this same tool could have better results.