Heterologous expression of a large biosynthetic gene cluster from streptomyces sp. BY in vitro CAS9 endonuclease means coding for an antifungal compound applied to agricultural pathgen control

Abstract

El objetivo principal de este trabajo es identificar, aislar y expresar heterólogamente mediante CAS9 in vitro un cluster de genes biosintéticos de un policétido con actividad antifúngica contra hongos fitopatógenos de importancia científica/económica en la agricultura chilena y mundial, entre ellos, Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea. En el primer capítulo (4) se busca establecer una colección tanto de potenciales biocontroladores del filo Actinomycetota (Streptomyces, Micromonospora) como de fito-patógenos fúngicos de importancia agrícola, con la finalidad de detectar nuevos metabolitos secundarios para biocontrol. Se cuenta con aislados de ambos filos de microorganismos procedentes de muestras de suelo capturadas en el desierto de Atacama y aislados de campo, respectivamente. Ambas colecciones cuentan solo con una caracterización fenotípica, por lo que se aplica una caracterización molecular mediante secuenciación para realizar una clasificación taxonómica de mayor precisión a través de DNA barcodes. Se obtiene como resultado 15 aislados de Streptomyces, con alta actividad antifúngica, y 10 aislados de fito-patógenos fúngicos de diversos géneros clasificados taxonómicamente a nivel molecular. Como segundo objetivo, se aplican diversas metodologías controlador-patógeno en ensayos de actividad antifúngica para definir los aislados de Streptomyces candidatos a análisis subsecuentes. Experimentos de cromatografía líquida asociado a espectrometría de masas (LC-MS/MS) revelan dos resultados de interés: por un lado la cepa Streptomyces sp. S29 es productor de una sorprendente diversidad de desferrioxaminas, mecanismo por el cual produce su actividad antifúngica. Por otro lado, Streptomyces sp. G35A muestra mediante análisis de redes moleculares (GNPS) la producción de análogos de anfotericina, potenciales responsables de su actividad antifúngica. Contar con las secuencias genómicas de las dos cepas de interés S29 y G35A resulta muy útil para avanzar en la comprensión de la producción de sus respectivos compuestos de interés. Es por esto que, según se detalla en el segundo capítulo (5), se aplica una combinación de secuenciación de lecturas largas / baja calidad por Nanopore y lecturas cortas / alta calidad por Illumina para tras aplicar pipelines bioinformáticos generar ensambles de estos genomas. Se obtienen contigs de alta cobertura para ambas cepas que permiten realizar los estudios a nivel genético. Con esto se determina la secuencia de DesC, una de las enzimas de la ruta de síntesis de desferrioxamina que podría ser la responsable de la diversidad molecular que muestra S29. Por otro lado, se propone, en base al análisis de predicción de clústers biosintéticos, un cluster de una PKS tipo I posiblemente responsable de la producción de los compuestos relacionados a anfotericina. En el tercer capítulo (6) se centra en la expresión heteróloga de clusters mediante Cas9 in vitro. Se clona, expresa heterólogamente en Escherichia coli y purifica mediante cromatografía de afinidad la proteína Cas9 procedente de Streptococcus pyogenes. Se propone la utilización del cluster de actinorodína de Streptomyces coelicolor A3(2) como control para el establecimiento de la técnica, por su reducido tamaño y pigmentación del producto. Se valida la actividad de la in vitro Cas9 preparada utilizando amplicones de los extremos del cluster. Luego, se prepara y valida la extracción de gDNA íntegro en agarosa de S. coelicolor A3(2) mediante electroforésis de campo pulsado utilizando un equipo desarrollado en el contexto de este trabajo: openPFGE. Esta extracción es sometida, sin éxito, a digestión in vitro mediante Cas9.