Desarrollo de un sistema de expresión de la glicoproteína spike de la variante lambda de SARS-CoV-2 basado en el virus recombinante de la estomatitis vesicular

Abstract

La pandemia provocada por severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2), causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha generado un enorme impacto de salud pública a nivel mundial y graves consecuencias económicas. El surgimiento de nuevas variantes ha sido una de las principales dificultades debido a que pueden facilitar la entrada celular y/o replicación del virus y presentar sensibilidad reducida a la neutralización por anticuerpos inducidos por infecciones previas o vacunación. En Chile, la variante lambda tuvo una alta incidencia en los meses de invierno de 2021, su glicoproteína spike contiene mutaciones que sugieren una transmisibilidad mayor que las variantes que la precedieron, presentó una alta circulación en Latinoamérica y fue clasificada por la OMS como una variante de interés. Sin embargo, una limitante para el estudio de SARS-CoV-2 y sus distintas variantes son las estrictas normas de biocontención requeridas para su cultivo, cuyo acceso es escaso y de alto coste en todo el mundo. Actualmente, se ha descrito al virus de la estomatitis vesicular recombinante (rVSV) decorado con la glicoproteína spike de SARS-CoV-2 ancestral Wuhan-Hu-1, el cual permite estudios con menores medidas de bioseguridad que las requeridas para el virus auténtico. No obstante, el surgimiento de variantes ha generado la necesidad de producir información de manera individual, debido a que presentan distintas ventajas en el “fitness viral” y escape al sistema inmune. Para abordar esto, en el presente Seminario de Título se generó un virus recombinante rVSV decorado con la glicoproteína spike de la variante lambda del SARS-CoV-2, que contiene además el gen reportero de la proteína fluorescente verde mejorada. Para el diseño de la secuencia nucleotídica que codifica para la glicoproteína spike de la variante lambda, se descargaron secuencias del genoma de SARS-CoV-2 desde Global initiative on sharing all influenza data (GISAID) correspondientes a la secuenciación de muestras de individuos infectados con la variante lambda del virus en distintas regiones de Chile. Luego, con el uso de herramientas bioinformáticas se generó una secuencia consenso de 3.738 nucleótidos, la cual contuvo las mutaciones características en el gen de la glicoproteína spike de la variante lambda de SARS-CoV-2. Tras obtener la secuencia sintetizada, se procedió a subclonar en el vector de destino pVSV generando el plasmidio recombinante pVSV-SARS-CoV-2-S-λ, el cual junto a plasmidios auxiliares, se transfectaron en células HEK293FT. Se analizó la expresión de spike y eGFP mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia de células transfectadas. Los resultados obtenidos indicaron que se obtuvo la síntesis de spike y además, la generación de partículas virales rVSV-SARS-CoV-2-S-λ con las cuales se infectó células Vero E6 en sucesivas rondas de infección. Este virus permite evidenciar de manera rápida y fácil, la infección en células de mamífero a través de la detección de emisión de fluorescencia de eGFP. Como conclusión, se ha desarrollado una herramienta eficiente y de gran valor para la salud pública que permite estudios moleculares de entrada viral y neutralización de la variante SARS-CoV-2 lambda que se puede manejar en laboratorios con niveles de bioseguridad estándar, que además puede modificarse y adaptarse para futuras variantes de SARS-CoV-2.

The pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2), which causes coronavirus disease 2019 (COVID-19), has generated a huge public health impact worldwide and serious economic consequences. The emergence of new variants has been one of the main difficulties because they can facilitate cell entry and/or virus replication and have reduced sensitivity to neutralization by antibodies induced by previous infections or vaccination. In Chile, the lambda variant had a high incidence in the winter months of 2021 and its spike glycoprotein contains mutations that suggest greater transmissibility than the variants that preceded it. Lambda had a high circulation in Latin America and was classified by the WHO as a variant of interest. However, a limitation for the study of SARS-CoV-2 and its different variants are the strict biocontainment standards required for its culture, access to which is scarce and expensive throughout the world. Currently, recombinant vesicular stomatitis virus (rVSV) that codes for enhanced green fluorescent protein has been decorated with spike glycoprotein from ancestral SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1, which allows studies with lower biosafety measures than those required for the authentic virus. However, the emergence of variants has generated the need to produce information individually for each one because they have different advantages in "viral fitness" and escape the immune system. To address this, in this thesis, a recombinant rVSV virus decorated with the spike glycoprotein of the lambda variant of SARS-CoV-2 was generated, which allows studies of the viral entry into cells and verify its subsequent expression in transfected cells by flow cytometry. For the design of the nucleotide sequence that codes for the spike glycoprotein of the lambda variant, SARS-CoV-2 genome sequences were downloaded from the global initiative on sharing all influenza data (GISAID) corresponding to the sequencing of samples from individuals infected with the lambda variant in different regions of Chile. Then, with the use of bioinformatic tools, a consensus sequence of 3,738 nucleotides was generated, which contained the characteristic mutations in the spike glycoprotein gene of the lambda variant of SARS-CoV-2. This sequence was subcloned into the pVSV destination vector, generating the recombinant plasmid pVSV-SARS-CoV-2-S-λ which, together with auxiliary plasmids, were transfected into HEK293FT cells. Spike and eGFP expression were analyzed by flow cytometry and fluorescence microscopy of transfected cells. The results show the detection of spike synthesis and also the generation of rVSV-SARS-CoV-2-S-λ viral particles that allowed the infection of Vero E6 cells in successive passages. Furthermore, this virus allows the detection of infection in mammalian cells through eGFP fluorescence emission. In conclusion, an efficient and highly valuable tool has been developed for public health studies. It allows molecular studies of viral cell entry and neutralization of the SARS-CoV-2 lambda variant that can be handled in laboratories with standard biosafety measures, which can also be modified and adapted for future variants of SARS-CoV-2.