Implementación del sistema CRISPR/Cas9 para la edición génica en fagocitos de salmón del Atlántico

Abstract

Los salmónidos son un grupo de peces de amplio interés acuícola a nivel mundial, pero hay una limitada disponibilidad de herramientas para estudiar la función de sus proteínas codificadas. Actualmente, una de las técnicas más utilizadas para investigar el rol de una proteína en mamíferos es la edición génica vía CRISPR/Cas9; sin embargo, su uso en salmónidos ha mostrado limitaciones debido a la baja eficiencia de transfección de plásmidos y proteínas, especialmente en fagocitos. Considerando este problema, en este seminario de título se estandarizó un protocolo de edición génica en fagocitos de salmón (línea SHK-1) vía CRISPR/Cas9. Para esto, se desarrolló y seleccionó una línea SHK-1 reportera fluorescente, mediante la transfección del plásmido pEGFP×2-N1, que expresa dos copias del gen que codifica para la proteína fluorescente verde (EGFP). La población seleccionada (SHK-1 EGFP+) fue utilizada para validar la capacidad de editar los genes que codifican para EGFP, para lo cual se diseñó y sintetizó un ARN guía (gRNA) in vitro para editar este gen, el cual fue posteriormente transfectado en las células SHK-1 EGFP+ junto a la enzima Cas9. Los resultados obtenidos, indican la pérdida de fluorescencia de la proteína EGFP con un rendimiento mayor al 95 %, lo cual fue estimado por fluorometría y microscopía. La evaluación de la mutación fue confirmada mediante secuenciación, observándose la inclusión de un codón de término en el gen que codifica para la EGFP, lo que produce la traducción de un péptido trunco. Estos resultados en su conjunto permiten demostrar que, a pesar de las dificultades intrínsecas del modelo, es posible editar genes de interés en fagocitos de salmón del Atlántico mediante CRISPR/Cas9, de manera eficiente y específica, lo que ofrece una oportunidad de estudiar en mayor detalle el genoma de esta especie.

Salmonids are a group of fish with aquacultural interest worldwide, but the tools to study the function of their proteins are limited. Currently, one of the most widely used techniques to investigate the role of a protein in mammals is gene editing via CRISPR/Cas9; however, its use in salmonids has shown limitations due to the low efficiency of plasmid and protein transfection, especially in phagocytes. Considering this problem, in this work, a gene editing protocol was standardized in salmon phagocytes (cell line SHK-1) via CRISPR/Cas9. For this, a fluorescent reporter SHK-1 line was developed and selected by transfecting the plasmid pEGFP×2-N1, which expresses two copies of the gene that codes for the green fluorescent protein (EGFP). The selected population (SHK-1 EGFP+) was used to validate the ability to edit the genes that encode for EGFP, for which a guide RNA (gRNA) was designed and synthesized in vitro to edit this gene and then transfected with the enzyme Cas9 into the SHK-1 EGFP+ cells. These results indicated the loss of fluorescence of the EGFP with a yield greater than 95%, which was estimated by fluorometry and microscopy. The mutation was confirmed by sequencing, observing the inclusion of a stop codon in the gene that encodes for EGFP, which produces the translation of a non-fluorescent peptide. As a whole, these results allow us to demonstrate that, despite the intrinsic difficulties of the model, it is possible to edit genes of interest in Atlantic salmon phagocytes using CRISPR/Cas9, in an efficient and specific manner, which offers an opportunity to further study in detail the genome of this species.