Estudio de la fosforilación y tráfico de megalina : posible papel de GSK3

Abstract

Megalina es una proteína de transmembrana de 600 kDa miembro de la familia de receptores LDL que se expresa en la cara apical de células polarizadas, principalmente del epitelio absortivo, como en el rifi6n, pulm6n y tiroides. Este receptor tiene una importante participacion en la uni6n y endocitosis de variadas moléculas como apolipoproteinas, vitaminas y hormonas con sus proteínas transportadoras y otros. Megalina posee un ectodominio con cuatro dominios de union a ligandos, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático con varios motivos, tales como un motivo rico en prolinas un motivo de interaccion con dominios PDZ, motivos de LL, NPXY, NxxY y YXxdy y sitios de consenso de fosforilaci6n por PKC, PKA y CK-ll. Debido al gran tamaño de megalina, los estudios del trafico intracelular y su regulaci6n no se pueden realizar con el receptor completo. En esta tesis se hicieron construcciones derivadas de megalina, es decir minireceptores, para facilitar su estudio. Se generaron clones de células estables evaluándose nivel de expresión, correcto plegamiento y expresi6n en la superficie celular de los minireceptores. Evidencias de nuestro laboratorio han demostrado que el dominio citos6Iico de megalina es fuertemente fosforilado in vivo e in vitro y que el motivo determinante en la fosforilacion corresponde a un residuo de serina que se encuentra dentro del motivo rico en prolinas PPPSP. En esta tesis se determino que, en células de fenotipo polarizado MDCK, que expresan minireceptores de megalina, la fosforilación disminuye significativamente al mutar la serina, del motivo rico en prolinas distal, por una alanina y que el efecto de esta disminuci6n increment6 la expresion de la mutante en la superficie de la célula. Este fen6meno no se debi6 a una variaci6n en la velocidad de

internalizacion sino a un aumento en el reciclaje del receptor. Puesto que el motivo PPPSP es un sitio consenso para la quinasa glic6geno sintasa 3 (GSK3) se analizo el efecto de los inhibidores de esta quinasa, Licl y S8216763, en la fosforilacion y trafico de minireceptores de megalina en MDCK y megalina endogena en células BN. Se demostró que, en ambos casos, en presencia de los inhibidores la fosforilacion del receptor disminuye. Bajo esas condiciones, las células BN exhibieron un aumento en la expresi6n de megalina en la superficie y en las celulas MDCK expresando los minireceptores se midio un aumento en el reciclaje de los receptores. Estas evidencias muestran que la fosforilacion regularla negativamente el reciclaje de megalina y que GSK3 estaría participando directamente en el proceso