Caracterización de la actividad de oxidasas de la biosíntesis de giberelinas en rizobacterias simbiontes de leguminosas

Abstract

Las giberelinas (GAs) son fitohormonas diterp5nicas que participan en diversas etapas del crecimiento y desarrollo de las plantas. Ademas de ser producidas por los sistemas vegetales, son sintetizadas como metabolitos secundarios por algunos hongos y rizobacterias. Particularmente el simbionte de la soya Brczc7nyfrJ.zob!.2t7„ /.apo#!.c#m contiene un oper6n de 8 genes que codiflcan para enzimas de la biosintesis de GAs, los queseexpresanenlascondicionesdemicroaerobiosispresentesenlosn6dulosradiculares de las plantas de soya. Los genes incluyen tres genes de monooxigenasas P450, un gen hom6logoadesliidrogenasas/reductasasdecadenacorta,ungendeferredoxina,dosgenes de diterpeno ciclasas y un gen de prenil transferasa. Aunque recientemente se demostr6 en nuestro grupo de investigaci6n que los bacteroides de 8. jcrpo77j.c#w presentan una alta actividad de oxidasas de GAs, no se conocen las funciones cataliticas asociadas a cada uno de los genes del oper6n. En esta Tesis se investigaron las .funciones cataliticas asociadas a dos de los genes de monooxigenasas del oper6n de 8. /.c7po7!j.a"w asi como al gen de deshidrogenasa/reductasa. Mediante la utilizaci6n de mutantes bloqueadas en genes individuales se identificaron en bacteroides de las mutantes las reacciones de la biosintesis de GAs ausentes, que corresponderfan a las catalizadas por la enzima bloqueada. Se administr6, a una suspensi6n de bacteroides, precursores de GAs marcados con ]4C y los productos generad6s se aislaron e identificaron mediante cromatografia de gases acoplada a espectrometrfa de masas. Una de las mutantes en genes de monooxigenasas metaboliz6 efectivamente al acido e#f-]4C-kaurenoico y no metaboliz6 al precursor mss oxidado GAi2. Los productos obtenidos a partir del acido e#f-]4C-kaurenoico fueron diferentes de los de la cepa silvestre. La segunda mutante no metaboliz6 al acido e#f-]4C-kaurenoico pero convirti6 efectivamente a precursores que poseen el esqueleto del e73f-giberelano para dar los productos mas oxidados ]4C-GAi5 y/o [4C-GA24. Finalmente se encontr6 que la mutante en el gen de la deshidrogenasa metaboliz6 precursores kaurenoides aunque con baja eficiencia. Los resultados sugieren que tanto la C20 oxidasa de GAs como la e#fkaurenoico oxidasa de 8. /.czpo#j.c#7# son monooxigenasas P450. La deshidrogenasa del oper6n catalizarfa algunas de las reacciones de oxidaci6n de la secuencia biosint6tica. Las actividades de e7?/-kaurenoico oxidasa y C20 oxidasa de GAs se encontraron termhii6n en b&cterofdes de Hhizobium phaseoli, Hhizobium etli, Rhizobium tropici y Si.79o7.faj.zoo;."w 7%e/i./of!.. Tanto los productos finales como la naturaleza de las enzimas de la biosintes!s de GAs de a. /.opo7!z.cz/j7! difleren de ]as que presentan plantas y hongos. Todas las especies de j2riz.zob!.z" estudiadas sintetizan GA9 como producto fmal a diferencia de los sistemas vegetales que sintetizan GAi y/o GA4. V1

Gibberellins(GAs)areditelpenephytohormonesthatparticipateindifferentstages of plant\ growth and development. Besides plants, they are produced as se.condary metabolites by some fungi and rhizobacteria. Particularly the soybean symbiont Brcrdgr¢j.zobz."" /.c7po7».c#w contains an operon of 8 genes that encodes for the enzymes ofGAbiosynthesiswliichareexpressedunderthemicroaerobicconditionspresentinroot nodules of soybean plants. These genes include tllree P450 monooxygenase genes, a gene with homology to short chain dchydrogenase/reductase genes, a ferredoxin gene, two diterpene cyclase genes and a prenyl transferase gene. Recently our research group showed that 8. /.crpo#z.c"#¢ bacteroids present a high GA oxidase activity. However, the catalytic functions associated to each gene of the operon are unknown. In this work the catalytic functions of the enzymes encoded by two of the monooxygenase genes were investigated as well as those of the dehydrogenase/reductase gene. Utilizing knock-out mutants in specific single genes the reactions of GA biosynthesis that are absent were identified in bacteroids of each of the mutants. These would correspond to the reactions catalyzed by the blocked enzyme. ]4C-labelled GA precursors were added to a bacteroids suspension and the generated products were isolated and identified by gas chromatography-mass spectrometry. One of the mutants efficiently metabolized e#/-]4C-kaurenoic acid but it did not metabolize added [4C-GAi2, a more oxidized precursor. Tlie products obtained from e77f- ]4C-kaurenoic acid were different to those formed by the wild type 8. /.apo#j.c#772 strain. The second mutant did not metabolize e#/-]4C-kaurenoic acid but converted efficiently several GA precursors into the oxidized products `4C-GAi5 and/or [4C-GA24. Finally, the mutantblockedinthedehydrogenasegenemetabolizede#f-kaurenoidprecursorsaltliough with a low efficiency. The results suggest that GA C20 oxidase as well as e#f-kaurenoic acid oxidase are P450 monooxygenases. The dehydrogenase encoded in the GA gene operon would catalyze some of the oxidative reactions of GA biosynthesis. e#f-Kaurenoic acid oxidase as well as C20 oxidase activities were also found in R.hizobium phaseoli, RIrizobiun etli, Khizobium tropici and Sinorhizobium meliloti bacteroids. Final products as well as enzymes of GA biosynthesis in 8. /.apo#z.cw#e differ fromthoseinplantsorfungi.AllJZ¢J.zobz.#mspeciesanalyzedinthisworksynthesizeGA9 as final product in contrast to plant systems that synthesize GAL and/or GA4.