Estudio de las Propiedades Dinámicas del Citoesqueleto y Análisis de Mutantes de Efecto Materno Durante la Segregación Ovoplásmica

Abstract

La distribuci6n de organelos y determinantes citoplasmalicos Gambia durante la ovog6nesis, pero adquiere un cierto patr6n en el zigoto. Asi, se forman dominios citoplasmaticos, que son ordenadamente transferidos a los diferentes blast6meros durante las divisiones de clivaje. Vistosos movimientos del ovoplasma (citoplasma rico en organelos y ribonucleoproteinas), que ocurren durante el desalTollo temprano del huevo del pez cebra, hacen posible la redistribuci6n y el establecimiento de dominios citoplasmaticos de importancia morfogen6tica. Este proceso se conoce con el nombre de segregaci6n ovoplasmica, iniciado durante la ovog6nesis, reanudado despu6s de la activaci6n del huevo y concluido durante la embriog6nesis. El resultado del estudio de zigotos tratados con drogas, que despolimerizan importante en el flujo de citoplasma durante la segregaci6n ovoplasmica. Por lo tanto, el conocimiento de las propiedades dinamicas de los microthbulos y filamentos de actina es sustancial para comprender c6mo se localizan organelos y determinantes matemo§. Por otro lado, la aplicaci6n de variadas t6cnicas gen6ticas y moleculares tanto en modelos de invertebrados como vertebrados, ha permitido la identificaci6n de mutaciones de efecto matemo que afectan procesos tempranos del desarrollo, pudiendo llegar a detenerlo. Por lo tanto, el conocimiento de la identidad de los genes matemos y la funcionalidad de sus productos es fundamental para determin`ar c6mo es regulado el desarrollo temprano en vertebrados. Comprender como el citoesqueleto participa en la segregaci6n ovopldsmica y ' como este proceso prepara el zigoto para la embriog6n6sis es el principal objetivo de este trabajo. Para satisfacer este prop6sito se eligi6 el zigoto del pez cebra, con el cual se investigaron los siguientes t6picos: a) analisis detallado de los movimientos ovopldsmicos que ocurren en el zigoto y embri6n temprano del pez cebra, quejunto al citoesqueleto y motores moleculares participan en el traslado de organelos y macromol6culas para formar el blastodisco, lugar que originari el embri6n y b) analisis de mutantes de efecto matemo cuyos fenotipos muestran alteraciones en la segregaci6n y distribuci6n de dominios de ovoplasma. Los resultados indican que la segregaci6n ovoplasmica en el zigoto del pez cebra trascurre en tres estados correlacionados con cambios nucleares que caracterizan el primer ciclo celular y que la fomaci6n del blastodisco se asocia con la reorganizaci6n y el transporte hacia el polo animal de ovoplasma desde la esfera ultraripido y a traves de nitas precisas de transporte. Ademas, distintos transcritos matemos e inclusiones citoplasmaticas co.distribuyen en 6stos canales de transporte o "streamers" y probablemente se mueven junto a diferentes motores moleculares a trav6s de una delicada red tridimensional de microthbulos y filamentos de actina. Concomitantemente, pulsaciones, dependientes de filamentos de actina, ocurren en general a alta frecuencia a lo largo del eje animal/vegetal del zigoto y embri6n temprano, contribuyendo al transporte de ovoplasma hacia el blastodisco. El analisis fenotipico y del flujo de ovoplasma en mutantes de efecto matemo sugieren lo siguiente: I) que el producto del gen bwcky bcz// (b#c) 6s responsable del establecimiento de la polaridad animal/vegetal durante la ovog6nesis. Ademas, participa en la regulaci6n de la organizaci6n y funcionamiento ., del citoesqueleto involucrado en la segregaci6n ovoplasmica, ya que el flujo unidireccional de ovoplasma hacia el blasto.disco, observada en el zigoto silvestre, se transforma en un flujo multidireccional hacia la periferia en el zigoto mutante. Se confirma asi, Ia p6rdida de la polaridad descrita por la mutaci6n de 6ste gen y 2) que el producto del gen emzf/s'i.ow (effl/7) regularia tambi6n el patr6n de organi2aci6n del citoesqueleto y los movimientos citoplasmaticos del zigoto, ya que el flujo de ovoplasma es mas lento que en el zigoto silvestre, afectando el traslado de deteminantes citoplasmaticos de gran importancia morfogen6tica hacia el blastodisco. Importantes resultados se ham obtenido durante este trabajo en relaci6n al clonamiento posicional y la identificaci6n molecular del gen e"#. Este codifica para el intercambiador Ca2+AI+ 6 Caxl (CAtion/proton exchanger 1), proteina requerida para el mantenimiento de la homeostasis de estos iones durante la desaITollo temprano de un vertebrado. Futuros estudios funcionales permitirin averiguar c6mo el gen a.mH/cclx./ regula los movimientos citoplasmaticos durante la segregaci6n ovoplasmica.

The distribution of organelles and eytoplasmic determinants changes during oogenesis, but acquire a certain pattern of distribution in the zygote. This leads to fomation of cytoplasmic domains, which are orderly transferred to different blastomeres during cleavage divisions. Evident ooplasm (cytoplasm rich in organelles and ribonucleoproteins) movements during. early development of the zebrafish egg, allow the redistribution and establishment of cytoplasmic domains of great morphogenetic importance. This process is known as ooplasmic segregation, initiated during oogenesis, reactivated after egg activation and concluded during embryogenesis. The study of zygotes treated with drugs that depolymerize microtubules and actin filaments, indicates that the cytoskeleton plays an important the dynamic properties of microtubules and actin filaments is substantial to understand how organelles and matemal determinants become localized. On the other hand, the application of various genetic and molecular techniques to both vertebrate and invertebrate organisms allowed the identiflcation of matemal effect mutations that affect early developmental processes. Therefore, knowledge of the identity of the matemal genes and the functionality of their products is essential to detemine how development is regulated in early vertebrate development. An understanding of how the cytoskeleton participates in ooplasm.ic segregation and how this process prepares the zygote for embryogenesis is the main aim of this work. To this end the following topics were investigated: a) detailed ' analysis of oopla;mic movements taking place in the zebrafish zygote and early embryo, that together with the cytoskeleton` and molecular motors are involved in the transpolt of organelles and macromolecules to form the blastodisc, region that will originate the embryo and b) analysis of in.atemal-effect mutants whose phenotypes show alterations in the segregation and distribution of ooplasmic domains. Results indicate that ooplasmic segregation in the zebraflsh zygote ocurrs in three steps correlated with nuclear changes that characterize the first cell cycle and that the formation of the blastodisc is associated with ooplasm reorganization and transport to the animal pole from the yolk cell. Ooplasmic flow occurs at different speeds: slow, fast and ultrafast and along precise transportation routes. In addition, different matemal transcripts and cytoplasmic inclusions codistribute along these transport channels or "streamers" and probably move together with different microtubules and actin filaments. Actin filament-dependent pulsations generally occurr at high frequency along the animal/vegetal axis of the aygote and early embryo, contributing to the transport of ooplasm toward the blastodisc. A phenotypical analysis and the study of ooplasmic flow in matemal-effect mutants, suggest. the following: 1) that the product of the b#cky bcrJJ (bwc) gene is required for the establishment of animal/vegetal polarity iduring oogenesis. Futhermore, the gene product participates in the regulation of cytoskeleton organization and function because it transforms the nomal unidirectional ooplasm flow toward the blastodisc, into a multidirectional flow toward the periphery of the mutant. This result confirmed the loss of animal/vegetal polarity described for the gene mutation and 2) that the product of the em#/sJ.on (emH) gene appears to regulate thepattemoforganizationofthecytoskelet6nandthecytoplasmicmovements of the zygote. Thus, the ooplasmic flow occurs slower than in the wild type zygote affecting the trapsfer 6f cytoplasmic determinants to the blastodisc. Interesting results concerning with the postional cloning and molecular identi.fication of the emj? gene have been reported in this thesis work. This encodes a Ca2+tr exchanger or Caxl (CAtion/proton exchanger I), prot9in required for the maintenance of ions homeostasis during embryogenesis. This appear to be the first Ca2+tr transporter studied in early vertebrate development. Future functional studies are expected to show how the eHi;7 gene regulates the cytoplasmic movements during ooplasmic segregation.