Participación del receptor de IP3 en la inserción de canales de potasio tipo shaker en la membrana plasmática de ovocitos de xenopus laevis

Abstract

Desde su sitio de síntesis, en los ribosomas, hasta su lugar de destino, en la membrana, Las proteínas de la membrana plasmática (MP) son transportadas en vesículas que atraviesan varias y complejas estructuras membranosas intracelulares. Estas proteínas se insertan a la MP por un mecanismo denominado genericamente exocitosis constitutiva. Si bien la exocitosis constitutiva opera en todas las c6lulas eucariotas, el desconocimiento de un factor desencadenante que la active, como en la exocitosis regulada, hace difícil abordar su estudio. Hemos desarrollado una estrategia electrofisiológica para medir en tiempo real la incorporación a la MP de los ovocitos de xenepus leavis de proteínas de membrana expresadas hetero lógicamente. En esta técnica se aprovecha la gran actividad especifica de los canales de potasio (KT) activados por voltaje del tipo Shaker y se mide el aumento de la corriente ionica para monitorear la incoaporacion de nuevos canales a la MP. Luego de inyectar ovocitos de .xenopus con CRNA que codifica para el canal Sfecz4er disminuimos la temperatura de incubaci6n a 4°C (|3°C por debajo de la temperatura normal de incubaci6n). Este arresto por temperatura induce una interrupci6n de la expresi6n superficial de los canales Shaker Al retomar a temperatura ambiente (20°C), la actividad superficial de canales crece 3-20 veces en el curso de una hora. Este crecimiento fue insensible a inhibidores de la síntesis proteica y a bloqueadores de trafico vectorial desde el RE al Aparato de Golgi, sugiriendo que este aumento de corriente representa etapas tardías del trafico de proteinas a la MP. La insercion de canales a la MP fue insensible a calcio (Ca2+) extracelular, pero sensible a Ca2+ intracelular, de manera que indica que es producido por una señal espacial y temporalmente localizada. Tratamientos con Tapsigargina e inyecciones de Heparina detuvieron la insercion de los canales en la MP, sugiriendo que la fuente de Ca2+ es mediada por receptores de IP3 (IP3R), localizados en el Reticulo Endoplasmatico (RE). En este trabajo quisimos: a) demostrar que los IP3R presentes en el RE participan en la insercion de los canales posterior a su arresto y b) identificar el compartimiento intracelular donde los canales de K+ quedan arrestados. La inhibición de IP3R con un anticuerpo especifico o con un antagonista, reducen el trafico a la MP, sugiriendo que los IP3R estin involucrados en este proceso. La inhibicion de la síntesis de IP3 detuvo el trafico de los canales, sin embargo, la inyeccion de este mensajero secundario no intensificaron el transporte, indicando que los IP3R estan'an mckimamente activos a concentraciones basales de IP3. Los análisis de Western blot a partir de muestras de membranas totales como de MP' purificada de ovocitos no arrestados indicaron la presencia de las formas inmadura (con glicosilacion rica en manosas adquirida en el RE) y madura (con las cadenas de azucares modificadas en el Golgi). Sorprendentemente, en los ovocitos arrestados encontramos mayoritariamente la forma inmadura del canal en ambos tipos de fracciones. Estos resultados indican que el trafico de esta proteína puede ocurrir independientemente de la glicosilacion en el Golgi. En concordancia con estos resultados, en el fraccionamiento subcelular aparecen bandas de la especie inmadura en todas las fracciones. Estos antecedentes nos permiten postular que durante el arresto por temperatura, los canales quedan retenidos en su trafico a la MP. Una vez terminado el protocolo de enfriamiento, podemos postular dos modelos: a) los canales transitan desde el RE, donde recibieron su primera etapa de glicosilacion, hacia la MP saltandose el paso por el Aparato de Golgi o b) los canales, acumulados durante el arresto en la cercania de la MP, posiblemente el Red Trans Golgi (Trans Golgi network = TGN), comienzan a llegar a la MP. Los canales se transportan atravesando el RE, donde reciben su primera etapa de glicosilacion y posteriormente pasan a través del Aparato de Golgi sin sufrir modificacion en sus azucares. Este proceso es regulado por el Ca2+ proveniente desde el RE a traves del IP3R, a los niveles basales de IP3 presentes en el ovocito