Encapsulación de fagos en perlas de alginato para el delivery de fagoterapia en acuicultura contra vibrios

Abstract

La acuicultura en Chile es una industria importante y en constante crecimiento, contando con múltiples especies acuáticas como productos. Sin embargo, uno de los desafíos que enfrenta la acuicultura es el control de enfermedades que afectan a los organismos cultivados; donde la vibriosis es una de las enfermedades bacterianas, más recurrentes, especialmente en etapas larvales. El Vibrio alginolyticus es un Vibrio que afecta a un rango amplio de huéspedes en la acuicultura en Chile, especialmente en condiciones de altas densidades de cultivo y contaminación por residuos orgánicos. Actualmente, el manejo de la vibriosis y otras infecciones bacterianas, se basan en el control de ambientes y uso frecuente de antibióticos. Sin embargo, el uso excesivo de estos últimos ha derivado al aumento en la frecuencia de selección de bacterias resistentes, incentivando un impulso a la generación de estrategias alternativas. La Fagoterapia ha ganado un renovado interés, con el uso de bacteriófagos como agentes para el control de bacterias patógenas, por su capacidad de infectar y lisar a las bacterias hospederas específicas. No obstante, la susceptibilidad de los fagos a agentes externos entorpece el desarrollo de esta técnica como terapia antibacteriana al presentar desventajas al administrar y almacenar los bacteriófagos. En el presente estudio se tuvo por objetivo diseñar perlas de alginato para el delivery de fagos contra vibrios en acuicultura. Para poder completar esta meta, se comenzó con la caracterización de los fagos previamente aislados en el laboratorio de Biotecnología del INTA. Se contó con 8 fagos que presentaban la capacidad de lisar a la cepa patógena GV09 (V. alginolyticus), donde solo 2 de los 8 fagos resultaron como altamente virulentos por su EOP. Estos fueron los fagos Ch20 y Ca8 que presentaron una caracterización muy similar, lisis trasparentes, DNA bicatenario, además de similares tiempos de adsorción y latencia. Sin embargo, un análisis DGREA reveló que los fagos son genéticamente diferentes. Luego se procedió con el análisis de cinética de infección del fago con un mayor Burst Size, definido como el número de viriones liberados por bacteria infectada, correspondiente al fago Ch20. Donde se observó una reducción del crecimiento bacteriano mediante absorbancia y recuento de UFC/ml. Finalmente se encapsuló el fago bajo 3 condiciones de % final de alginato (% v/v) en solución para determinar el % que permitiese la mayor tasa de difusión del fago al medio. Como resultado las perlas al 2% final de alginato (% v/v) en solución presentaron una mayor tasa de difusión tras 5 horas de ensayo con respecto a las perlas al 3%. Por lo tanto, se seleccionaron las perlas al 2% para determinar la viabilidad del fago bajo distintas condiciones de almacenamiento, con respecto a la temperatura usada. Obteniéndose dentro de los primeros 15 días una mejor estabilidad del fago encapsulado a 4 °C, y para el caso del fago no encapsulado, después de 30 días de almacenamiento, este presentó una mejor estabilidad de su título a -80°C. Por lo que los resultados muestran el potencial de la encapsulación de fagos en perlas de alginato para el delivery y almacenamiento de fagos en acuicultura.

Aquaculture in Chile is an important and constantly growing industry, with multiple aquatic species as a product. However, one of the challenges facing aquaculture is the control of diseases affecting cultured organisms, where vibriosis is one of the most recurrent bacterial diseases, especially in larval stages. Vibrio alginolyticus is a Vibrio that affects a wide range of hosts in aquaculture in Chile, especially in conditions of high culture densities and contamination by organic waste. Currently, the management of vibriosis and other bacterial infections is based on environmental control and frequent use of antibiotics. However, the excessive use of antibiotics has led to an increase in the frequency of selection of resistant bacteria, encouraging the generation of alternative strategies. Phage therapy has gained renewed interest, with the use of bacteriophages as agents for the control of pathogenic bacteria, due to their ability to infect and lyse specific host bacteria. However, the susceptibility of phages to external agents hinders the development of this technique as an antibacterial therapy by presenting disadvantages when administering and storing bacteriophages. The objective of the present study was to design alginate beads for the delivery of phages against vibrios in aquaculture. In order to complete this goal, we started with the characterization of the phages previously isolated in the Biotechnology laboratory of INTA. There were 8 phages with the ability to lyse the pathogenic strain GV09 (V. alginolyticus), where only 2 of the 8 phages were found to be highly virulent due to their EOP. These were the phages Ch20 and Ca8 that presented very similar characterization, transparent lysis, double-stranded DNA, as well as similar adsorption and latency times. However, a DGREA analysis revealed that the phages are genetically different. Then we proceeded with the analysis of infection kinetics of the phage with a higher Burst Size, defined as the number of virions released per infected bacterium, corresponding to phage Ch20. A reduction of bacterial growth was observed by absorbance and CFU/ml count. Finally, the phage was encapsulated under 3 conditions of final % of alginate (% v/v) in solution to determine the % that allowed the highest rate of phage diffusion to the medium. As a result, the beads at 2% final alginate (% v/v) in solution presented a higher rate of diffusion after 5 hours of testing with respect to the beads at 3%. Therefore, the 2% beads were selected to determine the viability of the phage under different storage conditions, with respect to the temperature used. A better stability of the encapsulated phage was obtained within the first 15 days at 4 °C, and in the case of the non-encapsulated phages, after 30 days of storage, it presented a better stability of its titer at -80 °C. Therefore, the results show the potential of phage encapsulation in alginate beads for phage delivery and storage in aquaculture.