Relative contribution of the pKpVP plasmid and the GIE492 and ICEKp10 genomic islands to the Klebsiella pneumoniae virulence over the zebrafish host model

Abstract

La transferencia horizontal de genes y los elementos genéticos móviles (EGMs) juegan un papel fundamental en el desarrollo de patógenos bacterianos que presentan rasgos fenotípicos de relevancia clínica, como por ejemplo, resistencia a antibióticos o una mayor dotación de factores de virulencia. Este es el caso de cepas hipervirulentas de Klebsiella pneumoniae, causantes de abscesos hepáticos y otras infecciones metastásicas graves, las cuales cuentan con diversos genes asociados a la virulencia, parte de los cuales están codificados en EGMs. En particular, dichas cepas frecuentemente portan las islas genómicas GIE492 e ICEKp10, y el plásmido de virulencia pKpVP, aunque se desconoce la contribución relativa de cada uno de estos EGMs en distintas etapas del proceso infectivo. Hasta la fecha, el estudio de estas cepas hipervirulentas se ha descrito en modelos de hospedero mamíferos, los cuales presentan una serie de limitaciones éticas y de infraestructura. Por ello, tomando en cuenta las ventajas que ofrece el modelo Danio rerio (pez cebra) y que sus larvas han sido usadas como hospedero de otras cepas de K. pneumoniae (no hipervirulentas), en esta Tesis se propuso estudiar la contribución relativa de estos EGMs en el proceso infeccioso de la cepa hipervirulenta modelo K. pneumoniae SGH10, usando larvas de pez cebra como modelo de hospedero. Para ello, se usaron métodos de infección por inmersión estática y microinyección localizada en la vesícula ótica, determinando que el modelo de pez cebra es adecuado para el estudio de estas cepas. Además, se observó que la capacidad de esta cepa de generar infecciones extraintestinales reportada en mamíferos se recapitula en el modelo de pez cebra. Respecto a la contribución de los EGMs bajo estudio en la virulencia mediante ensayos de inmersión, no se observaron diferencias significativas en la colonización intestinal ni en la letalidad de la cepa SGH10, comparada con mutantes que carecen de uno o más EGMs. Junto con esto, en los ensayos de microinyección se determinó que la cepa que carece del plásmido pKpVP presentó un menor grado de virulencia. En relación a la respuesta del sistema inmune ante las infecciones con estas cepas se observó que la mutante ΔICEKp10-GIE492 y la cepa curada del plásmido pKPvP presentaron un menor reclutamiento de neutrófilos en el sitio de infección, lo que sugiere que uno o más factores codificados en dichos EGMs contribuyen a la inmunogenicidad de estas cepas.

Horizontal gene transfer and mobile genetic elements (MGEs) play a fundamental role in the development of bacterial pathogens that present clinically relevant phenotypic traits, such as antibiotic resistance or an increased number of virulence factors. This is the case of hypervirulent strains of Klebsiella pneumoniae, causing liver abscesses and other severe metastatic infections, which have several virulence-associated genes, part of them encoded in EGMs. In particular, such strains frequently carry the genomic islands GIE492 and ICEKp10, and the virulence plasmid pKpVP, although the relative contribution of each of these EGMs at different stages of the infectious process is unknown. To date, the study of these hypervirulent strains has been described in mammalian host models, which present several ethical and infrastructural limitations. Therefore, taking into account the advantages offered by the Danio rerio (zebrafish) model and that its larvae have been used as a host for other (non-hypervirulent) K. pneumoniae strains, in this Thesis, we proposed to study the relative contribution of these EGMs in the infectious process of the hypervirulent K. pneumoniae SGH10 model strain, using zebrafish larvae as a host model. For this purpose, methods of infection by static immersion and localized microinjection in the otic vesicle were used, determining that the zebrafish model is suitable for studying these strains. In addition, it was observed that the ability of this strain to generate extraintestinal infections reported in mammals is recapitulated in the zebrafish model. Regarding the contribution of the EGMs under study in virulence by immersion assays, no significant differences were observed in intestinal colonization or lethality of strain SGH10 compared to mutants lacking one or more EGMs. Conversely, in microinjection assays, it was determined that the strain lacking the pKpVP plasmid presented a lower degree of virulence. In addition, regarding the immune system's response to infections with these strains, the ΔICEKp10-GIE492 mutant and pKpVP-cured strain presented lower recruitment of neutrophils at the site of infection, suggesting that one or more factors encoded in these EGMs would contribute to the immunogenicity of hypervirulent K. pneumoniae.