Clonación y expresión recombinante del Gen de α-glucuronida del hongo Gloeophyllum trabeum en Pichia pastoris

Abstract

El contexto actual mundial de cambio climático, escasez de recursos y exceso de desechos obliga a aprovechar los residuos generados. La biomasa lignocelulósica (BLC) es un tipo de residuo agrícola que abarca una amplia gama de materiales y se compone principalmente de celulosa, lignina y hemicelulosa. Se ha descubierto que a partir de la hidrólisis de este último compuesto (conformado en su gran mayoría por xilano de diversos tipos), se pueden generar xilooligosacáridos (XOS), prebióticos con importantes beneficios para la salud humana y animal. Uno de los métodos de producción de XOS utilizados en la actualidad es la hidrólisis enzimática del xilano, para lo que, además de xilanasa (principal enzima del proceso), se necesita de una serie de enzimas auxiliares que aumentan el rendimiento del proceso, dentro de las cuales se encuentra la α-glucuronidasa. Si bien, se han descubierto hongos como Gloeophyllum trabeum, capaces de producir de forma nativa esta enzima, el proceso es complejo y posee una baja eficiencia, por lo que evaluar su producción recombinante en un hospedero como Pichia pastoris resultaría ser una alternativa conveniente en términos económicos y de mejora del proceso de producción de XOS. Así, el objetivo general de esta memoria es clonar y expresar en forma recombinante el gen de α-glucuronidasa de G. trabeum en P. pastoris, y evaluar su actividad enzimática. Mientras que los objetivos específicos son: aislar el gen de α-glucuronidasa del hongo G. trabeum, clonar el gen de α-glucuronidasa de G. trabeum en P. pastoris, y expresar α-glucuronidasa de forma recombinante en P. pastoris y evaluar su producción. Dado el trabajo realizado, fue posible cumplir con todos los objetivos planteados. Se aisló el gen de α-glucuronidasa de G. trabeum (GtAGluc), al ser clonado exitosamente en el vector pGEM-T Easy. Se clonó el gen de GtAGluc en el vector pPIC9K, lo que permitió generar clones recombinantes de P. pastoris, resistentes a concentraciones de 0,5 mg/mL y 1 mg/mL del antibiótico Geneticina®. Se evaluó la producción recombinante de GtAGluc en cultivos de P. pastoris, concluyéndose que es muy probable que la enzima de interés se produzca, pero que esto ocurra en bajas cantidades, dado que los niveles de actividad enzimática obtenidos se encontraban bajo el umbral mínimo necesario (establecido por el fabricante del kit utilizado para su medición), pero al mismo tiempo se logró registrar la producción de una proteína cercana al tamaño esperado de la α-glucuronidasa (112 kDa). Se especula que este resultado podría atribuirse, principalmente, al tamaño del gen de GtAGluc (aproximadamente 3 kb). Con lo descrito, se concluyó que el objetivo general de esta memoria fue cumplido, al haberse clonado y expresado en forma recombinante el gen de α-glucuronidasa de G. trabeum, para luego haberse evaluado su actividad enzimática.