Activación del sensor IRE1α de la Respuesta a proteínas mal plegadas (“Unfolded protein response”, UPR) en células dendríticas intratumorales

Abstract

Dendritic cells (DCs) have emerged as attractive candidates in the cancer immunotherapy field due to their high plasticity and the capacity to regulate adaptive immunity. As a major organelle responsible of protein synthesis, the endoplasmic reticulum (ER) represents a central hub of the immune response onset, as it contributes to key immunological processes including the regulation of the antigen presentation routes, the differentiation of secretory immune cells, and the control of inflammation, by means of cytokine production. Remarkably, tumor cells grow at expenses of the host and imposes a high degree of cellular stress. A relevant cellular stress in cancer relates to the accumulation of unfolded proteins in the ER lumen of tumor-infiltrating immune cells, causing ER stress and activating an intracellular signaling cascade known as the Unfolding Protein Response (UPR). The UPR is a three-pronged signal transduction pathway responsible to maintain protein homeostasis in the ER, and it has shown to control crucial processes in the biology of DCs including ER architecture, expression of integrins and antigen presentation. Therefore, manipulation of UPR could be a rising strategy to modulate DCs function during the activation of the antitumoral immune response. In this thesis work, we studied how the tumor niche activates the UPR branch controlled by the sensor IRE1α and its transcription factor XBP-1s, in DCs infiltrating tumors and tumor draining lymph nodes (TdLNs), in a murine model of melanoma induced by inoculation of B16-OVA cells. For this purpose, we used two approaches: First we identified cDC1 and cDC2 cell subtypes with an active IRE1α RNAse activity at the tumor and TdLNs of mice, by an strategy of multiparametric 14-colors flow cytometry and the use of a transgenic mice line, ERAI (ER stress Activated Indicator[1]). ERAI mice carry the mRNA sequence of XBP-1s, which is spliced by IRE1α, fused to Venus FP, allowing the quantification of the activation of IRE1α in vivo. Second, we quantified the expression of XBP-1s and RIDD target genes in sorted intratumoral DCs, which allowed the quantification of the activation of the IRE1α-XBP-1s and the IRE1α-RIDD axis. Our results indicate that high levels of IRE1a RNase activity is selectively induced in the intratumoral cDC1s lineage of DCs. The outcome of this activation was evidenced by enhanced ERAI signal, high amounts of XBP-1s mRNA and decreased expression of RIDD targets, which was selectively noticed in the tumor site compared to the draining lymph node. These data indicate that the tumor site elicit strong activation of IRE1a RNase activity in cDC1, which is the most immunogenic antigen presenting cell type infiltrating Tumors. Current work is focused on unveiling which branch of IRE1 RNase regulates the acquisition of an immunogenic profile in tumor cDC1.

Las células dendríticas (DCs) han surgido como atractivas candidatas en inmunoterapia del cáncer, debido su alta plasticidad y a su capacidad de regular la inmunidad adaptativa. Siendo el principal organelo responsable de la síntesis de proteínas, el retículo endoplasmático (RE) es un foco central en el inicio de la respuesta inmune, ya que contribuye a procesos inmunológicos claves que incluyen la regulación de rutas de presentación de antígenos, la diferenciación de células inmunes de naturaleza secretora, y el control de la inflamación mediante la producción de citoquinas. Notablemente, el crecimiento de diversos tipos de tumores expone señales capaces de inducir la acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del RE de células inmunes, lo que origina estrés de RE, activando una cascada de señalización intracelular conocida como respuesta a proteínas mal plegadas o UPR por su sigla en inglés “Unfolded Protein Response”. La UPR es una vía transducción de señales de tres ejes responsable de mantener la homeostasis proteica en el RE, ya que ha demostrado controlar procesos cruciales en la biología de las DCs tales como la arquitectura del RE, expresión de integrinas y presentación antigénica. Por esta razón, la manipulación de la UPR podría ser una estrategia prometedora para modular la función de DCs durante la activación de la respuesta inmune anti-tumoral. En este trabajo, se estudió cómo el nicho del tumor activa el eje de la UPR controlado por el sensor IRE1α y su factor de transcripción XBP-1s, en DCs infiltrantes de tumor y linfonodo drenante de tumor (TdLN) en un modelo murino de melanoma inducido vía inoculación de células B16-OVA de melanoma. Para ello, el trabajo se centró en dos enfoques: Primero se identificaron los subtipos cDC1 y cDC2 que presentaron una activación de la actividad RNasa de IRE1α en el tumor y TdLN mediante citometría de flujo multiparamétrica de 14 colores empleando los ratones transgénicos, ERAI (ER stress Activated Indicator[1]). Los ratones ERAI contienen la secuencia de XBP-1s, la cual es cortada por IRE1α, fusionada a Venus FP, permitiendo la cuantificación de la activación de la enzima in vivo. Segundo, se cuantificó la expresión de genes blanco de XBP-1s y de RIDD en DCs sorteadas de tumor y TdLN, lo cual permitió la cuantificación de la activación de los ejes IRE1α-XBP-1s y IRE1α-RIDD. Nuestros resultados indican altos niveles de actividad RNasa de IRE1a selectivamente en el linaje cDC1s de DCs intratumorales. La consecuencia de esta activación fue evidenciada en una señal ERAI aumentada, cantidades elevadas de ARNm de XBP-1s y disminuida expresión de mRNAs blanco de RIDD, lo cual fue observado de manera selectiva en tumor en comparación a linfonodo drenante. Estos datos indican que el nicho tumoral induce una fuerte activación de la actividad RNasa de IRE1a en cDC1, la cual corresponde a la célula presentadora de antígenos más eficiente de las infiltrantes de tumores. Nuestro trabajo actual está focalizado en identificar cuál rama de la actividad RNasa de IRE1 regula la adquisición de un perfil inmunogénico en las cDC1 de tumor cDC1.