Desarrollo de un protocolo de estimulación crónica de linfocitos T CD8+ para la evaluación del rol del receptor de adenosina A2A (A2AR) en el establecimiento del agotamiento

Abstract

Los linfocitos T CD8+ son células del sistema inmune adaptativo que, una vez activadas por células presentadoras de antígenos, se diferencian a células citotóxicas cumpliendo un rol importante en la respuesta inmune antitumoral. Sin embargo, en los tumores, las células T citotóxicas entran en un estado hipofuncional llamado agotamiento debido a la exposición crónica al antígeno. El microambiente tumoral además presenta una gran concentración de adenosina, molécula que promueve un entorno inmunosupresor. Al unirse al receptor A2A (A2AR), la adenosina suprime la actividad citotóxica y la capacidad de producir citoquinas por parte de las células T CD8+ , desconociéndose aun si este nucleósido cumple un papel en la inducción del agotamiento. Así, el objetivo de este trabajo es desarrollar un protocolo de activación crónica in vitro de los linfocitos T CD8 de manera de intentar dilucidar el rol del A2AR en el establecimiento del agotamiento. Para esto, en primer lugar, se desarrolló un protocolo de activación crónica de células T CD8+ utilizando beads conjugadas con anticuerpos anti CD3/CD28 para estimular al receptor del linfocito T en presencia de diferentes citoquinas. Utilizando este protocolo de activación en presencia de un medio suplementado con IL-7 e IL-15, pudimos obtener células que presentan un fenotipo de agotamiento pero que mantienen características de células troncales. Por el contrario, al suplementar el medio con IL-2 e IL-12, se obtuvo un mayor porcentaje de células con un fenotipo de terminalmente agotadas. A continuación, para evaluar el papel de A2AR en el establecimiento del agotamiento in vitro, se realizó una aproximación farmacológica utilizando un antagonista (SCH58621) y un agonista (NECA) del receptor A2A, obteniendo resultados que sugieren que la señalización a través de A2AR reduce el agotamiento. Finalmente, se utilizaron células T CD8+ de ratones knockout condicionales para A2AR en los cultivos in vitro para evaluar la participación de A2AR en el agotamiento de las células T CD8+ . Sin embargo, utilizando esta estrategia no fue posible encontrar diferencias en el agotamiento en células T CD8+ A2ARKO en comparación con células T CD8+ WT, lo que sugiere que la deleción del A2AR no afecta el establecimiento del agotamiento de linfocitos T CD8+ en las condiciones de diferenciación in vitro analizadas en este trabajo. En conclusión, en este trabajo se logró generar un protocolo de activación policlonal para la diferenciación de células T CD8+ agotadas in vitro. Además, los resultados indican que el bloqueo farmacológico de los receptores de adenosina mediante la utilización del antagonista SCH58261, aumenta la frecuencia de células agotadas terminalmente diferenciadas, lo cual sugiere que la activación de los receptores A2AR reduce el agotamiento terminal in vitro

CD8+ T lymphocytes are cells of the adaptative immune system that once activated by antigen-presenting cells, differentiate into cytotoxic cells, fulfilling an essential role in the antitumor immune response. However, cytotoxic T cells enter a hypofunctional state in tumors called exhaustion due to the chronic exposure to tumor antigens. The tumor microenvironment also presents a high adenosine concentration, a molecule known to promote an immunosuppressive environment. By binding to the A2A receptor (A2AR), adenosine suppresses cytotoxic activity and the ability to produce cytokines by CD8+ T cells, although it is not yet clear whether this nucleoside plays a role in inducing exhaustion. Thus, this work aims to develop a protocol to chronically activate CD8+ T cells in vitro to elucidate the role of A2AR in establishing the differentiation of exhausted CD8+ T lymphocytes. First, a CD8+ T cell chronic activation protocol was developed using anti-CD3/CD28 conjugated beads to stimulate the T lymphocyte receptor in the presence of different cytokines. Using this activation protocol in a medium supplemented with IL-7 and IL-15, we obtained cells that display an exhaustion phenotype but maintain stem cell characteristics. On the other hand, when supplementing the medium with IL-2 and IL-12, a higher percentage of cells with a terminal exhaustion phenotype was obtained. Next, to evaluate the role of A2AR in the establishment of exhaustion in vitro, a pharmacological approach was carried out using an antagonist (SCH58621) and an agonist (NECA) of the A2A receptor, obtaining results that suggest that signaling through A2AR reduces CD8+ T cell exhaustion. Finally, CD8+ T cells from A2AR conditional knockout mice were used in in vitro cultures to further assess the role of A2AR in CD8+ T cell exhaustion. However, using this approach, it was not possible to find differences in the exhaustion of CD8 + A2ARKO T cells compared to CD8+ WT T cells, suggesting that A2AR deletion does not affect the establishment of CD8+ T cell exhaustion under the differentiation conditions analyzed in this work. In conclusion, in this work, it was possible to generate a polyclonal activation protocol for the differentiation of exhausted CD8+ T cells in vitro. In addition, the results indicate that pharmacological blockade of adenosine receptors using the antagonist SCH58261 increases the frequency of differentiated terminally exhausted T cells, suggesting that A2AR activation reduces terminal exhaustion in vitro