Estudio de la participación del citoesqueleto de actina y la producción de ROS durante la maduración fagosomal en microglías”

Abstract

Las microglías son las células del sistema inmunológico que residen en el cerebro y, por lo tanto, actúan como la principal defensa inmunológica contra patógenos y enfermedades neurológicas que afectan el sistema nervioso central (SNC). La fagocitosis es una de las funciones principales de las microglías, que implica la endocitosis de agentes grandes (>0,5 µm), lo que les permite eliminar patógenos y agregados neurotóxicos característicos de diversas enfermedades neuropatológicas. Una vez que los agentes dañinos son ingeridos, las microglías forman un compartimento especializado llamado fagosoma. A pesar de la importancia fisiológica del fagosoma, se ha estudiado principalmente en otras células del sistema inmunológico, por lo que ha sido poco explorado en las microglías. De particular relevancia es el citoesqueleto de actina, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad de ciertas Rho GTPasas, como RhoA, en el desarrollo y maduración adecuados del fagosoma. Sin el funcionamiento adecuado de estos elementos, la digestión y eliminación de agentes dañinos no serían posibles. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis fue estudiar la dinámica del citoesqueleto de actina, la producción de ROS y la actividad de RhoA en la maduración del fagosoma microglial utilizando un modelo de fagocitosis. Para observar la dinámica de la actina a través de la microscopía confocal, se emplearon sondas genéticas como LifeAct-GFP y Utrophin-mScarlet. Utilizando estas sondas, se descubrió un fenómeno dinámico del actina, denominado "destellos de actina", en las microglías, que no se había reportado previamente. Además, mediante el uso de una sonda redox llamada OxyBurst, se construyó por primera vez la curva de producción de ROS intrafagosomal en microglías. Además, a través de ensayos de fagocitosis, se observó por primera vez la naturaleza cíclica y escalonada de la producción de ROS durante el estallido oxidativo. Para explorar una posible conexión entre los efectores de RhoA y la producción de ROS, se utilizaron inhibidores de ROCK, lo que resultó en una disminución en la magnitud del estallido oxidativo. Esto sugiere que RhoA está involucrado en la producción de ROS a través de su efector ROCK. Finalmente, mediante el uso de sensores FRET de segunda generación, se observó un aumento en la actividad de RhoA durante los destellos de actina. Los resultados indican que el citoesqueleto de actina, la producción de ROS y la actividad de RhoA están funcionalmente interconectados y son esenciales para el funcionamiento adecuado de la fagocitosis microglial. Los hallazgos de este seminario de tesis arrojan luz sobre los mecanismos moleculares de la maduración del fagosoma, lo que tiene implicaciones tanto en la ciencia básica como en la práctica clínica. Las disfunciones en la fagocitosis son inherentes al proceso de envejecimiento y a la progresión de diversas enfermedades neurodegenerativas, por lo que comprender la base molecular de este fenómeno podría ser útil para el desarrollo de nuevas estrategias para tratar numerosas enfermedades

Microglia are the immune cells that reside in the brain and, therefore, serve as the main immune defense against pathogens and neurological diseases affecting the central nervous system (CNS). Phagocytosis is one of the primary functions of microglia, involving the endocytosis of large cargoes (>0.5 um), allowing them to eliminate pathogens and neurotoxic aggregates which are characteristic of various neuropathologies. Once harmful agents are ingested, microglia form a specialized compartment called the phagosome. Despite the physiological importance of the phagosome, it has been primarily studied in other immune system cells and poorly explored in microglia. Of particular relevance is the actin cytoskeleton, the production of reactive oxygen species (ROS), and the activity of certain Rho GTPases, such as RhoA, in the proper development and maturation of the phagosome. Without the proper functioning of these elements, digestion and elimination of harmful agents would not be possible. Therefore, the objective of this thesis was to study the dynamics of the actin cytoskeleton, ROS production, and RhoA activity in the microglial phagosome maturation using a model of phagocytosis. To observe actin dynamics through confocal microscopy, genetic probes such as LifeAct-GFP and Utrophin-mScarlet were employed. Using these probes, a dynamic actin phenomenon, termed "actin flashes" was discovered in microglia, which had not been reported previously. Additionally, by employing a redox probe called Oxyburst, the curve of intra-phagosomal ROS production by microglia was constructed for the first time. Furthermore, through phagocytosis assays, the cyclic and stepped nature of ROS production during the oxidative burst was observed for the first time. To explore a potential connection between RhoA effectors and ROS production, ROCK inhibitors were used, resulting in a decrease in the magnitude of the oxidative burst. This suggests that RhoA is involved in ROS production through its effector ROCK. Finally, using second-generation FRET sensors, an increase in RhoA activity during actin flashes was observed. The results indicate that the actin cytoskeleton, ROS production, and RhoA activity are functionally interconnected and essential for the proper functioning of microglial phagocytosis. The findings from this thesis seminar shed light on the molecular mechanisms of phagosome maturation, which has implications in both basic science and clinical practice. Dysfunctions in phagocytosis are inherent in the aging process and the progression of various neurodegenerative diseases, so understanding the molecular basis of this phenomenon might be useful for the development of new strategies to treat numerous diseases