Estudio de la regulación de la síntesis de carotenoides y ergosterol en Xanthophyllomyces dendrorhous por la vía SREBP usando mutantes del gen crtE bajo el promotor HMGS

Abstract

Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura que sintetiza el carotenoide astaxantina, el cual tiene diversas aplicaciones biotecnológicas. La síntesis de carotenoides inicia con la condensación de dos moléculas de acetil-CoA, y luego con la formación de HMG-CoA, mediante la enzima hidroxi-metil-glutaril-CoA sintasa (gen HMGS), comparte pasos con la vía de ergosterol hasta la formación de farnesil-pirofosfato (FPP) comprometiendo a la vía del mevalonato. El primer paso hacia la síntesis de carotenoides es la formación de geranilgeranil-pirofosfato (GGPP) a partir de FPP catalizado por la GGPP sintasa (gen crtE). Se ha demostrado que la biosíntesis de astaxantina y ergosterol son reguladas por el factor de transcripción Sre1 de X. dendrorhous, y que el gen HMGS de la vía del mevalonato es un blanco de Sre1. El objetivo de este trabajo fue evaluar la regulación del promotor del gen HMGS, que posee sitios de unión de Sre1, al reemplazar el promotor del gen crtE por el promotor del gen HMGS y su efecto sobre la síntesis de carotenoides en mutantes de la levadura que poseen al factor Sre1 en su forma activa: cepa CBS.cyp61- que no produce ergosterol y sobreproduce carotenoides, cepa CBS.SRE1N.FLAG que sólo expresa la forma activa de Sre1 y sobreproduce carotenoides, y cepa silvestre (CBS6938). Para ello, mediante OE-PCR y experimentos de clonado molecular, se construyó un módulo que contiene el promotor de HMGS (pHMGS). Con esto se transformó las cepas en estudio, donde mediante recombinación homóloga se reemplazó el promotor de crtE por el promotor del gen HMGS. Los transformantes obtenidos CBS.pHMGS/crtE, CBS.cyp61-.pHMGS/crtE y CBS.SRE1N.FLAG.pHMGS/crtE fueron confirmados mediante PCR y se evaluaron los niveles de transcritos de crtE y la producción de carotenoides en comparación con sus respectivas cepas parentales. Los niveles de transcritos de crtE aumentaron en CBS.cyp61-.pHMGS/crtE y CBS.SRE1N.FLAG.pHMGS/crtE en más de tres y cuatro veces, respectivamente, y la producción de carotenoides incrementó 1,43 y 1,22 veces en las mismas dos cepas. Esto no se observó en la cepa CBS.pHMGS/crtE, que no posee Sre1 activo. Además, los niveles de transcritos de HMGS no se vieron alterados, evidenciando que el reemplazo del promotor del crtE no alteraría a la vía del MVA en sus inicios. Por lo tanto, reemplazar promotores de genes carotenogénicos por promotores regulados por Sre1 en cepas que poseen al factor de transcripción en su forma activa, favorece la producción de carotenoides en esta levadura.

Xanthophyllomyces dendrorhous is a yeast that synthesizes the carotenoid astaxanthin, which has various biotechnological applications. Carotenoid synthesis begins with the condensation of two molecules of acetyl-CoA, and then with the formation of HMG-CoA, through the enzyme hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (HMGS gene), it shares steps with the ergosterol pathway until the formation of farnesyl pyrophosphate (FPP), involving the mevalonate pathway. The first step towards carotenoid synthesis is the formation of geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) from FPP, catalyzed by GGPP synthase (crtE gene). It has been demonstrated that the biosynthesis of astaxanthin and ergosterol is regulated by the transcription factor Sre1 in X. dendrorhous, and the gene for hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (HMGS) in the mevalonate pathway is a target of Sre1. The objective of this study was to evaluate the regulation of the HMGS gene promoter, which contains Sre1 binding sites, by replacing the crtE gene promoter with the HMGS gene promoter and its effect on carotenoid synthesis in yeast mutants that possess the active form of the Sre1 factor: the CBS.cyp61- strain that does not produce ergosterol and overproduces carotenoids, the CBS.SRE1N.FLAG strain that only expresses the active form of Sre1 and overproduces carotenoids, and the wild-type strain (CBS6938). Using OE-PCR and molecular cloning experiments, a module was constructed containing the HMGS promoter (pHMGS). This module was used to transform the studied strains, where the crtE gene promoter was replaced by homologous recombination. The obtained transformants CBS.pHMGS/crtE, CBS.cyp61-.pHMGS/crtE, and CBS.SRE1N.FLAG.pHMGS/crtE were confirmed by PCR, and transcript levels of the crtE gene and carotenoid production were evaluated, and compared against their respective parental strains. Transcript levels of the crtE gene increased more than three and four times in strains CBS.cyp61-.pHMGS/crtE and CBS.SRE1N.FLAG.pHMGS/crtE, respectively, and carotenoid production increased 1.43 and 1.22 times in these two strains when compared to their corresponding parental strain. These increments were not observed in strain CBS.pHMGS/crtE, where Sre1 is not active. Furthermore, HMGS transcript levels were not altered, indicating that the replacement of the crtE promoter would not affect the MVA pathway at its outset. Therefore, replacing carotenogenic gene promoters with promoters from genes regulated by Sre1 in strains that have the Sre1 transcription factor in its active form, promote carotenoid production in this yeast.