Optimización de las condiciones de cultivo de células de paratiroides para terapia celular en Hipoparatiroidismo

Abstract

Introducción: El Hipoparatiroidismo permanente ocurre después de tiroidectomía (0,2-4% de los casos) o de cirugía paratiroídea. Los pacientes deben recibir suplementación de vitamina D y calcio de por vida. A nivel mundial, como alternativa terapéutica en estos pacientes, hay poca experiencia de alotrasplantes paratiroídeos. La dificultad de esta terapia es el rechazo por aloinmunización, y el establecimiento de cultivos primarios duraderos que permita conseguir una masa de células suficiente para el transplante. Con este último procedimiento, sólo sSe ha logrado mantener cultivos y función endocrina de ellos hasta 60 días. Nuestro objetivo fue modificar y optimizar los cultivos primarios de paratiroides humana para: a) obtener una línea continua de células paratiroídeas, b) caracterizar la línea en cuanto a función endocrina y optimizarla mediante cocultivo con células de granulosa humana y c) establecer las técnicas para llegar a la aplicación clínica de la misma (microencapsulación y criopreservación). La Hipótesishipótesis planteó que: lLa optimización de los cultivos de paratiroides humana y el cocultivo de éstas con células de granulosa humana (RCGH) como nodriza, aportará el microambiente glandular para mantener una función endocrina adecuada a largo plazo. A su vez, la microencapsulación mantendrá este microambiente y permitirá aún mayor duración y mejor función endocrina a largo plazo. Material y Métodos: Se obtuvieronLas muestras de paratiroides, fueron obtenidas de pacientes sometidos a paratiroidectomía subtotal por hiperparatiroidismo secundario, que y luego fueron procesadas con digestión enzimática y disgregación mecánica, cultivándose en medio de cultivo (DMEM /HF12) suplementado con suero bovino, suero fetal bovino y medio condicionado UCHT1, que induce proliferación e inmortalización (Método Caviedes y cols). Además, se criopreservaronó trozos de paratiroides de cada paciente en el banco de tejidos creado para este efecto. En las líneas celulares obtenidas con este procedimiento, se realizaronó cultivos celulares en monocapa, inmunohistoquímica anti paratohormona humana (PTH) y del receptor de calcio sensible (CaSR), tinción de la reacción del ácido per-iódico de Schiff (PAS), y 9 establecimiento de curva dosis respuesta de (calcio v/s. PTH). También, se evaluó la tumorigenicidad in vitro (crecimiento en agar blando). Por otra parte, se montó y evaluó las características de la técnica de microencapsulación celular y de tejidos, y se creó un banco de criopreservación de paratiroides en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile. En relación a nuestros Resultadosresultados, se logró establecer exitosamente : Todos los cultivos primarios fueron efectivos, con morfología típica a la microscopía. Estos, lograron un período de expansión de hasta 115 días. La función endocrina de las células obtenidas fue estudiada midiendo PTH en el medio de cultivo, determinándose. Se obtuvo una producción promedio de 521,6 pgr/ml en 24 hrs (224-730 pgr/ml). Sin embargo, sobrevino sobrecrecimiento fibroblástico y senescencia de las líneas primarias obtenidas (7 de 15 no expuestas a UCHT1). Una de ocho8 líneas cultivos celulares sometidoas al protocolo de inmortalización logró un crecimiento exponencial, sin senescencia ni sobrecrecimiento fibroblástico al ser expuesta al medio UCHT1. Esta pPresentó respuesta secretoria de paratohormona (PTH) dosis dependiente en relación inversa a la concentración de calcio extracelular. La linea n (al  calcio,  PTH). No manifestó características morfocinéticas de línea tumoral niy no proliferó en cultivos en suspensión (Agar Blando). La línea fue denominada RCPTH, y presentateniendo un tiempo de duplicación de 30 hrs y densidad de placa de 123.499 céls/cm2. Esta línea mantiene producción y secreción de PTH en el medio a más de 100 subcultivos. Por otra parte, al ser cocultivada con células de granulosa humana, presenta aumento del tiempo de duplicación y disminución del porcentaje de proliferación (incorporación de BrdU), además de una mayor secreción de PTH al medio. Finalmente, Se llevó a cabo la separación celular en gradientes de Percoll ®, permitió logrando obtener mayor proporción de células PTH (+) en la fracción 1.035-1.055 gr/dl. A su vez, se montaron exitosamente En cuanto a las técnicas de microencapsulación y criopreservación, fueron exitosamente montadas en nuestro país. En microencapsulación, se Se logró producir obtuvo esferas permeables y más resistentes al utilizar alginato de sodio al 2% gelificado con BaCl2 20 mM, las cuales permiten otorgar un ambiente inmunoprivilegiado a células microencapsuladas. A su vez, e. 10 El Banco de Criopreservación de paratiroides fue establecido exitosamente, teniendo el personal e infraestructura adecuados y cumpliendo rigurosamente las cadenas de frío y esterilidad, bajo estándares sanitarios. En cConclusióones: S, se logró establecer la única línea continua de paratiroides humana, descrita en el mundo con función secretoria normal a largo plazo. Además, se evidenció que en condiciones de cocultivo con células de granulosa humana existen mayores niveles de PTH secretado en el medio y efectos sobrereducción en la proliferación celular de la línea RCPTH, que puede traducir un efecto sobre la diferenciación que aumenta la secreción de PTH o la sensibilidad al calcio extracelular. Por otra parte, se montó la técnica de microencapsulación celular, estableciendo como ideales para el alotrasplante las microesferas de alginato de sodio al 2% con BaCl2 por sus características de permeabilidad, resistencia y vitalidad del tejido a largo plazo. El manejo de estas técnicas permitió ofrecer una nueva terapia no disponible hasta ahora en Chile, y prepara la aplicación futura de terapia celular con la línea RCPTH una vez realizadas las pruebas de tumorigenicidad in vivoy aprobada por la FDA. Así como también, se abren las puertas al desarrollo de nuevas líneas de investigación sobre optimización de cultivos, métodos de criopreservación (según tipo de tejido y/o tipo celular) y de microencapsulación (purificación de alginato de algas chilenas).

Permanent hypoparathyroidism occurs after thyroidectomy (0,2-4 % of all cases) or after surgery. The patients must receive vitamin D and calcium supplementation for life. In general, there is little experience in parathyroid allograft as a therapeutic alternative in these patients. The main difficulties of this therapy are the rejection for alloimmunization, and the establishment of long- lasting primary cultures to obtain a sufficient mass of cells for transplant. With the latter techniques, cultures that retain endocrine function have been maintained only up to 60 days. Our goal in this work was to modify and optimize primary cultures of human parathyroid tissue: a) to obtain a continuous cell line of parathyroid cells, b) to characterize this line in terms of its endocrine function and optimizing this function by coculture with a human granulosa cell line, and c) to establish the necessary techniques and skills to develop the clinical applications of the tissue (namely, microencapsulation and criopreservation). Our proposed hypothesis was that the optimization of human parathyroid cultures and their coculture with a human granular cell line (RCGH) for trophic support, would contribute to the reproduce the glandular microenvironment and thus preserve endocrine function in the long term. In turn, microencapsulation would further support this microenvironment and thus allow an even longer and better endocrine function. Parathyroid tissue samples were obtained from patients bearing secondary hyperparathyiroidism, who were submitted to partial parathyroidectomy. Tissue samples were processed by enzymatic digestion and mechanical disgregration, and cultured in liquid media composed of DMEM/HF12, supplemented with adult, fetal bovine serum and UCHT1 conditioned media, which induces proliferation and immortalization of mammalian cells. Also, parathyroid tissue from every patient was criopreserved in our Tissue Bank, which was created for this purpose. In the cell lines obtained with the procedure described above, monolayer cell cultures were used to study the presence of human parathyroid hormone (PTH) and expression of the calcium sensor (CaSR) by inmunohistochemistry, along with per-yodic Schiff (PAS) reaction, and determination of calcium vs. PTH dose response curves. Also, in vitro tumorogenicity was evaluated by studying growth on soft agar. Finally, we setup the 12 necessary techniques for cellular and tissue microencapsulation, and a parathyroid criopreservation bank was established cat the University of Chile Clinical Hospital. Regarding our results, we managed to successfully establish primary cultures, which exhibited typical morphology under microscopy. These cultures continued to expand for up to 115 days. Endocrine function of the cells was studied by measuring PTH in the culture media, which yielded an average production of 521,6 pgr/ml in 24 hrs (224-730 pgr/ml). Nevertheless, the cultures were overcome with fibroblast outgrowth and senescence (7 of 15 cultures not exposed to UCHT1). One of eight cell cultures submitted to the UCHT1 immortalization protocol achieved exponential growth, without senescence or fibroblast outgrowth. This cell line exhibited PTH secretion in response to decreasing concentration of extracellular calcium, and exhibited neither morphological nor cell cycle kinetics of a tumor line, nor did it proliferate in suspension culture conditions (Soft agar). The cell line was named RCPTH, and it exhibits a doubling time of 30 hrs and saturation density of 123.499 cells/cm2. This line continues to produce and secrete PTH in the media after having undergone over 100 subcultures. On the other hand, when cocultured with human granulosa cells, RCPTH cells increase their doubling time, they decrease the percentage of proliferating cells (as evidenced by BrdU uptake), in addition to an increase in PTH secretion to the media. Finally, cell separation in Percoll ® gradients revealed a greater proportion of PTH(+) cells in the 1.035-1.055 gr/dl. fraction. Further, microencapsulation and criopreservation techniques were successfully established. Regarding the former, we managed to produce permeable and highly resistant spheres by using 2% sodium alginate, gellified with BaCl2 20 mm. These spheres provide an immunoprivileged environment to microencapsulate cells. In turn, the Parathyroid Criopreservation Bank was successfully established, which comprises adequate personnel and infrastructure to rigorously fulfill the requirements of a cold chain and sterility. In conclusion, we managed to establish the only continuous human parathyroid cell line (RCPTH) in existence to date, and which retains normal secretory function. We also demonstrated that, when cocultured with human granulosa cells, RCPTH cells exhibit higher levels of PTH secretion and a reduced cellular proliferation, effects that could be 13 underlying a differentiation effect expressed either in increased PTH secretion and/or the sensitivity to extracellular calcium. Finally, we established microencapsulation conditions, and defined the use of 2% sodium alginate precipitated with BaCl2 as the ideal condition for microsphere-encapsulated allograft therapy, as defined by characteristics such as permeability, resistance and long term tissue vitality. This presents an option for a new therapy not available in Chile to date, and the possible future application of cell therapy using RCPTH cells, once tumorogenicity studies are completed. Further, the latter opens interesting possibilities for the development of new lines of research in the optimization of culture conditions, criopreservation methods (tailored for tissue or cell type) and microencapsulation (i.e., by purification of alginate from Chilean seaweed).