Efecto del peróxido de hidrógeno en la adherencia de la bacteria acidófila Leptospirillum sp. CF-1 a minerales sulfurados

Abstract

Los microorganismos acidófilos en ambientes extremadamente ácidos forman biopelículas en la superficie de minerales sulfurados. Estas biopelículas comienzan con una unión inicial de células a dichas superficies, impulsada por mecanismos celulares que interactúan con señales ambientales. Entre las señales potenciales, destaca la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) que se generan de manera espontánea en las superficies de los minerales sulfurados. Estas ROS podrían actuar como un como un desencadenante en la adherencia y posterior formación de biopelículas en estas condiciones extremas. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del H2O2 en la adherencia de Leptospirillum sp. CF-1 a superficies de minerales sulfurados. Para esto se utilizaron herramientas bioinformáticas para determinar los genes asociados con la adherencia, la señalización de c-di-GMP y mecanismos de quorum sensing. Luego de forma experimental se realizó la medición a lo largo del tiempo del H2O2 generado en una suspensión de gránulos de pirita, calcopirita y esfalerita. Posterior se evaluó la adherencia de Leptospirillum sp. CF-1 a cultivos que contenían cada mineral, con y sin la adición de diferentes concentraciones de H2O2 exógeno. La determinación de la adherencia se llevó a cabo mediante el recuento de células planctónicas y mediante el análisis de biopelículas por microscopía de barrido láser de fluorescencia (LSM). Finalmente se evaluó el efecto del H2O2 sobre el proteoma de Leptospirillum sp. CF-1 utilizando un análisis proteómico de las proteínas de cultivos planctónicos con y sin la adición de H2O2 exógeno. Los resultados indicaron la presencia de múltiples genes que codifican diguanilatociclasas y fosfodiesterasas, junto con el sistema DSF, el cual estaría implicado en la comunicación entre células (quorum sensing). Para la adherencia, identificamos la flagelina como el elemento estructural predominante. En la parte experimental se obtuvo que la pirita es el mineral que presenta una mayor producción de H2O2 en una suspensión a lo largo del tiempo en comparación con otros minerales (1 μM de H2O2 a las 8 horas). La adherencia a los minerales fue más elevada en la pirita, donde el 94% de las células se habían adherido a las 8 horas, superando a la calcopirita (78%) y la esfalerita (74%) en el mismo intervalo. La adición de H2O2 exógeno a los cultivos minerales aumentó aún más la adherencia, especialmente en la pirita, con un 99% de adherencia de las células a las 6 horas. Los experimentos de microscopía confirmaron esta tendencia, mostrando una mayor adherencia en la pirita en presencia de H2O2. De las proteínas obtenidas de la proteómica, se analizaron 347. De ellas, 41 correspondían a proteínas estructurales, 35 relacionadas a reacciones redox, 23 a la protección y respuesta al estrés, y 10 al mantenimiento y función de otras proteínas. Se destacó una alta abundancia de la chaperona GroES, una peroxirredoxina, una tiorredoxina y una rubreritrina como participantes en la respuesta a estrés, y diversas proteínas de membrana, lipoproteínas y la flagelina como elementos estructurales que participarían en la adherencia. Se puede concluir que Leptospirillum sp. CF-1 posee mecanismos importantes presentes en su genoma y proteoma relacionados a la adherencia, formación de biopelículas y respuesta al estrés oxidativo. Además, se proporciona evidencia de la generación de H2O2 en el tiempo en los distintos minerales sulfurados estudiados, de la adherencia diferenciada de Leptospirillum sp. CF-1 a cada uno de ellos y de como la adición de H2O2 exógeno estimula aún más la adherencia. Todo esto confirma la participación del H2O2 como activador y su posible rol como molécula señalizadora en la adherencia de Leptospirillum sp. CF-1 a minerales sulfurados.

Acidophilic microorganisms in extremely acidic environments form biofilms on the sulfide minerals surface. These biofilms initiate with an initial cell attachment, driven by cellular mechanisms interacting with environmental signals. Among the potential signals, the presence of reactive oxygen species (ROS) generated spontaneously on the surfaces of sulfide minerals stands out. These ROS could act as a trigger for adherence and subsequent biofilm formation under these extreme conditions. The aim of this study was to assess the effect of H2O2 on Leptospirillum sp. CF-1 adherence to sulfide mineral surfaces. Bioinformatics tools were used to identify genes associated with adherence, c-di-GMP signaling, and quorum sensing mechanisms. Subsequently, experimental measurements of H2O2 generated over time in suspensions of pyrite, chalcopyrite, and sphalerite granules were performed. Adherence of Leptospirillum sp. CF-1 to cultures containing each mineral was evaluated, with and without the addition of different concentrations of exogenous H2O2. Adherence determination involved planktonic cell counting and biofilm analysis using laser scanning fluorescence microscopy (LSM). Finally, the effect of H2O2 on the proteome of Leptospirillum sp. CF-1 was evaluated using proteomic analysis of planktonic cultures with and without the addition of exogenous H2O2. The results indicated the presence of multiple genes encoding diguanylate cyclases and phosphodiesterases, along with the DSF system, which would be involved in cell communication (quorum sensing). For adherence, flagellin was identified as the predominant structural element. Experimental data showed that pyrite had the highest H2O2 production over time in suspension compared to other minerals (1 μM of H2O2 at 8 hours). Adherence to minerals was highest on pyrite, with 94% of cells adhered at 8 hours, surpassing chalcopyrite (78%) and sphalerite (74%) in the same timeframe. The addition of exogenous H2O2 to mineral cultures further increased adherence, especially on pyrite, with 99% cell adherence at 6 hours. Microscopy experiments confirmed this trend, showing increased adherence on pyrite in the presence of H2O2. Of the proteins obtained from proteomics, 347 were analyzed. Among these, 41 corresponded to structural proteins, 35 were related to redox reactions, 23 to protection and stress response, and 10 to maintenance and function of other proteins. There was a high abundance of the chaperone GroES, a peroxiredoxin, a thioredoxin, and a rubrerythrin as participants in the stress response, as well as various membrane proteins, lipoproteins, and flagellin as structural elements involved in adherence. In conclusion, Leptospirillum sp. CF-1 possesses important mechanisms in its genome and proteome related to adherence, biofilm formation, and oxidative stress response. Additionally, evidence is provided for the generation of H2O2 over time on the different studied sulfide minerals, the differentiated adherence of Leptospirillum sp. CF-1 to each of them, and how the addition of exogenous H2O2 further stimulates adherence. This confirms the involvement of H2O2 as an activator and its possible role as a signaling molecule in the adherence of Leptospirillum sp. CF-1 to sulfide minerals.