Ingeniería metabólica de streptomyces leeuwenhoekii C43t, para aumentar la producción de chaxamicinas

Abstract

La resistencia antimicrobiana (ARM) de los microorganismos patógenos se incrementa año a año, generando problemas de salud en la población a nivel mundial. Para combatir la ARM se necesita de manera urgente encontrar nuevos metabolitos especializados. La cepa Streptomyces leeuwenhoekii C34T, aislada desde el desierto de Atacama, produce los compuestos chaxamicinas A–D los cuales han mostrado tener actividad antibiótica y antitumoral. Para estudiar la producción de los metabolitos especializados se ha generado un modelo metabólico a escala genómica (GSM), iVR1007. Por otra parte, la producción de metabolitos especializados por las cepas wild-type suele ser ineficiente para obtener la cantidad requerida para producir los compuestos de manera comercial. Es por esto que distintas técnicas de ingeniería metabólica se han usado para aumentar la producción de dichos compuestos, como lo es la sobreexpresión de genes clave. En el caso de las chaxamicinas, estas son producidas en baja cantidad por la cepa wild-type. Por estos motivos, en este trabajo, se evaluó el efecto de sobreexpresiones predichas por el GSM sobre la producción de chaxamicinas por la cepa S. leeuwenhoekii C34T. Los mutantes derivados de S. leeuwenhoekii C34T, que sobreexpresan los distintos genes seleccionados fueron obtenidos utilizando técnicas de clonamiento tradicionales. La cuantificación por HPLC de la producción de chaxamicinas se llevó a cabo usando un estándar interno de rifampicina y determinando las condiciones cromatográficas para obtener la separación de los picos de los compuestos de interés. En las muestras de sobrenadante se obtuvo un incremento en la producción de chaxamicinas en ocho de los nueve mutantes generados. El mutante que sobreexpresa el gen sle11600 fue el más efectivo en aumentar la producción, cuantificándose un aumento de 13.2 veces la producción de chaxamicina A, mientras que la producción total se incrementó 6.6 veces. El gen sle11600 codifica para una transcetolasa asociada a reacciones del ciclo de las pentosas fosfato y además a la producción del precursor de chaxamicinas, ácido 3-amino-5-hidroxibenzoico (AHBA). Es así como la sobreexpresión de este gen podría estar asociada a un aumento del poder reductor y a la producción de AHBA. Las muestras de extractos micelares presentaron bajas concentraciones de chaxamicinas en todas las muestras, incluido el wild-type. Finalmente, los incrementos en la producción detectados en los sobrenadantes se vieron reflejados en aumentos en la actividad antibiótica contra Micrococcus luteus. Este trabajo demuestra la efectividad de las sobreexpresiones predichas por el modelo metabólico, iVR1007, sobre el aumento en la producción de chaxamicinas.

Antimicrobial resistance (ARM) against pathogenic microorganisms increases every year, leading to health issues in the world-wide population. There is an urgent need to find new specialized metabolites to fight antimicrobial resistance. Streptomyces leeuwenhoekii C34T strain, isolated from the Atacama Desert, produces chaxamycins A-D which have shown antibiotic and antitumoral activities. A genome scale model (GSM), iVR1007, has been created to study the production of specialized metabolites by this strain. On the other hand, the production of specialized metabolites by wild-type strains usually does not fit commercial requirements. For this reason, different metabolic engineering techniques had been employed to increase the production of those compounds, such as overexpression of key genes. In the case of chaxamycins, they are produced in low amounts by the wild-type strain. For these motives, the effect of overexpression predicted by a GSM to increase chaxamycins production by S. leeuwenhoekii C34T, was evaluated in this work. The mutants that overexpress different selected genes were obtained using traditional cloning techniques. The quantification of chaxamycins was done by HPLC, using a rifamycin internal standard and through determination of the chromatographic conditions to obtain the separated peaks. mutants Increased production of chaxamycins was obtained in eight out of nine of the generated mutants. The mutant overexpressing the gene sle11600 was the most effective augmenting the production, getting a 13.2 fold increment of chaxamycin A production, while total chaxamycin production was of 6.6 fold than the wild-type. The gene sle11600 encodes for a transketolase associated to reactions of the pentose pathway and production of the chaxamycin precursor 3-amino-5-hydroxybenzoic acid (AHBA). Therefore, the overexpression of this gene could be related to an increase of reducing power and AHBA production. The mycelial extract samples showed low chaxamycin concentration, including the wild-type. Finally, the increased production detected in the supernatant was related with higher antibiotic activity against Micrococcus luteus. This work demonstrates the effectiveness of the overexpression predicted by the metabolic model, iVR1007, in increasing chaxamycin production.