Caracterización de clústeres de genes biosintéticos para la producción de azafilonas de carácter polar en el género fúngico Pseudogymnoascus

Abstract

El estudio del metabolismo secundario del género fúngico psicrotolerante Pseudogymnoascus es aún muy incipiente, iniciándose tan solo en la última década. Entre los metabolitos sintetizados por hongos de este género, destaca la producción de pigmentos rojos por distintas cepas aisladas, confirmada solo de manera visual, no existiendo información sobre la naturaleza, origen biosintético o propiedades químicas de estos pigmentos. Recientemente, en la cepa antártica Pseudogymnoascus verrucosus FAE27, se ha identificado un clúster de genes biosintéticos, el cual se denominó GymN, similar a los descritos para la síntesis de azafilonas, una familia de metabolitos secundarios con alto potencial biotecnológico por su amplio rango de actividades biológicas, y por su uso como pigmentos en diversas industrias. En este trabajo, se explora el potencial de biosíntesis de pigmentos del tipo azafilona en el género Pseudogymnoascus mediante una aproximación bioinformática a nivel de género, un análisis funcional del clúster GymN de la cepa Pseudogymnoascus verrucosus FAE27, y una caracterización de los pigmentos sintetizados por este clúster. Como resultado, se determinó la existencia en los genomas del género Pseudogymnoascus de seis clados de clústeres biosintéticos con el potencial de sintetizar azafilonas de estructura distinta a las sintetizadas por los clústeres descritos en otros géneros fúngicos. Particularmente, el clúster GymN en la cepa Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 posee un alto grado de similitud con los descritos en el género Monascus, Talaromyces e Hyphodiscus para la síntesis de azafilonas. Mediante atenuación génica, se comprobó que GymN está encargado de sintetizar pigmentos de coloración roja en la cepa Pseudogymnoascus verrucosus FAE27. También, se identificaron dos metabolitos de coloración anaranjada, estructuralmente relacionados entre sí, como potenciales intermediarios de la ruta biosintética de azafilonas en Pseudogymnoascus verrucosus FAE27. Mediante análisis de espectrometría de masas y de sus espectros visibles UV, se logró determinar que corresponden, con alta probabilidad, a azafilonas con características únicas que los diferencian de las descritas en otros géneros. Finalmente, se determinó que los pigmentos rojos extraídos desde cultivos en placa de la cepa Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 poseen un fuerte carácter polar en comparación a los aislados desde cepas del género Talaromyces, Monacus o Hiphodiscus. Adicionalmente, presentan una alta estabilidad frente a un amplio rango de pH y temperatura. Estas características hacen a estos pigmentos llamativos desde un punto de vista productivo con respecto a los procesos de extracción y aplicación. En resumen, este estudio pavimenta las bases químicas y genéticas para el estudio de la biosíntesis de azafilonas en el género fúngico Pseudogymnoascus.

The study of the secondary metabolism of the psychrotolerant fungal genus Pseudogymnoascus is still in its infancy, having begun only in the last decade. Among the metabolites synthesized by fungi of this genus, the production of red pigments by different isolates stands out but confirmed only visually, with no information on the nature, biosynthetic origin, or chemical properties of these pigments. Recently, in the Antarctic strain Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 a biosynthetic gene cluster has been identified, named GymN, similar to those described for the synthesis of azaphilones, a family of secondary metabolites with high biotechnological potential due to their wide range of biological activities and their use as pigments in various industries. In the present work, the potential for azaphilone pigment biosynthesis in the genus Pseudogymnoascus is explored through a bioinformatic approach at the genus level, a functional analysis of the GymN cluster in the strain Pseudogymnoascus verrucosus FAE27, and a characterization of the pigments synthesized by this cluster. As a result, the existence of six clades of biosynthetic gene clusters with the potential to synthesize azaphilones with different structure from those synthesized by clusters described in other fungal genera was determined in genomes of the genus Pseudogymnoascus. Particularly, the GymN cluster identified in the strain Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 has a high degree of similarity to those described in the genera Monascus, Talaromyces, and Hyphodiscus for the synthesis of azaphilones. Through gene attenuation, it was confirmed that the cluster GymN is responsible for synthesizing red pigments in the strain Pseudogymnoascus verrucosus FAE27. Additionally, two orange-colored metabolites, structurally related to each other, were identified as potential intermediates in the biosynthetic pathway of azaphilones in Pseudogymnoascus verrucosus FAE27. Through mass spectrometry analysis and UV-visible spectra, it was determined that they correspond, with high probability, to azaphilones with unique characteristics that differentiate them from those described in other genera. Finally, it was determined that the red pigments extracted from plate cultures of the strain Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 have a strong polar nature compared to those isolated from strains of the genera Talaromyces, Monascus, or Hyphodiscus. Additionally, they exhibit high stability over a wide range of pH and temperature. These characteristics make these pigments attractive from a production standpoint regarding extraction processes. In summary, this study lays the chemical and genetic groundwork for the study of azaphilone biosynthesis in the fungal genus Pseudogymnoascus.