Participación de panx-1 en la entrada de calcio acoplada a excitación (ecce) frente a estímulos despolarizantes en células musculares adultas de ratón

Abstract

Es bien sabido que, en las células excitables del músculo esquelético, estímulos eléctricos despolarizantes promueven la activación de diversos mecanismos celulares que son capaces de distinguir entre distintos rangos de frecuencia para su activación. Dentro de estos, se encuentra el acoplamiento excitación-contracción observado en tejido muscular, el cual se gatilla con estimulación tanto de alta como baja frecuencia, y que se sabe depende esencialmente de la interacción mecánica cruzada entre el canal de calcio (Ca2+) sensible a voltaje de tipo L (Cav1.1) de los túbulos T, y el receptor de Rianodina (RyR) en la membrana del retículo sarcoplasmático. Por otra parte, también existe el acoplamiento excitación-transcripción, el cual solo se activa a bajas frecuencias y depende de un macro-complejo proteico que incluye a tanto a Cav1.1 como al canal de Panexina 1 (Panx1), el cual permite la salida de ATP hacia el medio extracelular. Estas proteínas interactúan entre sí y favorecen un aumento intracelular de los niveles de Inositol trifosfato (IP3) y Ca2+ asociados con la regulación en la transcripción génica en músculo. En músculo esquelético también existe otro mecanismo conocido como entrada de calcio acoplada a excitación (ECCE), que se activa al estimular eléctricamente a bajas frecuencias y promueve la entrada de Ca2+ a través del sarcolema, de forma independiente a la depleción de Ca2+ desde los reservorios intracelulares. Actualmente se desconoce el canal específico por el cual se produce la entrada de Ca2+ al citoplasma, no obstante, se sabe que si bien requiere la presencia de Cav1.1 como RyR, el ingreso de Ca2+ no está mediado por canales de tipo L como Cav1.1. Recientemente se ha sugerido que Panexina 1 también es capaz de formar canales de gran poro que son permeables a Ca2+, de esta forma, en este trabajo se evaluó la posible participación de Panx-1 en ECCE en la mediación de la entrada de Ca2+ a la célula. Se evaluó la entrada de Ca2+ exclusivamente a través del sarcolema mediante la técnica de quenching de Mn2+, la cual se basa en el apagamiento de la señal fluorescente de la sonda de Ca2+ fura-2-AM, dada su afinidad con Mn2+. Los resultados muestran un apagamiento significativo en la señal fluorescente al incubar las fibras en medio Ringer Krebs con Mn2+ y libre Ca2+, el cual se ve favorecido con estimulación de baja frecuencia. Dicho apagamiento es anulado al aplicar fármacos inhibidores de Panx-1, sugiriendo que la proteína puede estar mediando tanto la salida de ATP como la entrada de Ca2+ al citoplasma durante el fenómeno de ECCE.

Depolarizing electrical stimuli promote activation of different cellular mechanisms that can in skeletal muscle. Within these is the excitation-contraction coupling, which is observed in both high and low frequency stimuli and depends on the participation and cross-mechanical interaction between Cav1.1 and RyR, on the other hand, there is the excitation-transcription coupling which is only activated at low frequencies and depends on a protein macro complex that includes Cav1.1 and Panx-1 in sarcolemma, which interact with each other, favoring the increase of intracellular IP3 and Ca2+ levels, which is associated with gene transcription. There is other mechanism that is activated by electrical stimulation at low frequencies and promotes Ca2+ entry through the sarcolemma, known as excitation-coupled calcium entry (ECCE), which does not depend on the emptying of Ca2+ from intracellular stores, it is independent of L-type Ca2+ currents and requires both the presence of Cav1.1 and RyR. The channel by which Ca2+ enters the cytoplasm in this mechanism is still unknown, however, it is proposed that there must be at least a third protein capable of interacting with Cav1.1 and/or RyR, which permeates the cation. This work seeks to evaluate the participation of Panx-1 in ECCE, due to the high conductance and expression of the channel in adult skeletal muscle, in addition to the interaction described between this protein with Cav1.1, which is required in the excitation-transcription coupling. The entry of Ca2+ was evaluated indirectly using Mn2+ quenching, a fluorescence technique whose mechanism is based on the quenching of the signal of the fluorescent probe fura-2-AM by affinity of Mn2+ to the probe when it enters. the cell. Results suggest that Panx-1 participates in ECCE, mediating the exit of ATP together with the entry of Ca2+ into the cytoplasm and that ECCE and excitation-transcription coupling are part of the same phenomenon.