Participación del canal de cloruro activado por calcio (tmem16a) en la contracción inducida por atp en células musculares lisas de venas intrapulmonares de rata

Abstract

Introducción: La unidad básica del músculo liso es la célula muscular lisa. La regulación de la contracción en la célula muscular lisa es a través de segundos mensajeros que abren canales intracelulares, presentes en el Retículo Endoplasmático (RE), liberando iones de calcio. Otra vía es por la entrada de calcio desde el medio extracelular por la activación de los canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC) generando contracción. El ATP es un agonista fisiológico que activa el receptor purinérgico acoplado a proteína Gq, Gs y Gi en la membrana celular. En nuestro laboratorio hemos visto que la contracción de las VIP inducida por ATP depende de la estimulación de los receptores metabotropos P2Y2/4 y la posterior activación de la fosfolipasa C beta (PCL-β), la producción de inositol trifosfato (IP3), la activación del receptor de inositol trifosfato (IP3R), la liberación de Ca2+, por lo tanto, aumento en la concentración intracelular de calcio [Ca2+]i y contracción. El cloruro es el anión intracelular más abundante en las células musculares lisas vasculares (CMLV) (~ 50 mM). Para su activación se requiere la unión de 2 iones de Ca2+ y el aumento de la permeabilidad de Cl-

. Como resultado, se produce la corriente de salida del ion cloruro generando despolarización de la membrana plasmática activando los VDCC, la entrada de Ca2+

, lo que favorece la mantención de la contracción. Resultados de estudios funcionales de contracción en VIP muestran que la contracción inducida por KCl es inhibida entre un 78.5% para Nimodipino y 95.8% para Nicardipino. Sorprendentemente, la contracción inducida por ATP es también inhibida entre un 45.4% para Nitrendipino y 86.4% para Nimodipino. Nosotros postulamos como hipótesis que esta inhibición por dihidropiridinas (DHP) en la contracción, cuando usamos ATP, se observa debido a la presencia de canales de cloruro activados por Ca2+ del tipo TMEM16A que despolarizan la membrana y consecuentemente activan los VDCC. Objetivo: Evaluar la participación del canal de cloruro activado por Ca2+ (TMEM16A) en la contracción muscular inducida por ATP en células musculares lisas de venas intrapulmonares pequeñas de ratas. Metodología: Se obtuvieron rebanadas de pulmones de ratas macho Sprague-Dawley (~430g) para realizar estudios de vasoconstricción e inhibición de VIP inducida a ATP en medio con NaI y con inhibidores como Ani9, T16AinhAO1 y Benzbromarona (Protocolo CBA1183 FMUCH). Los resultados de contracción son mostrados como la mediana ± S.E.M. Los datos fueron analizados con test no paramétrico Kruskal-Wallis con post hoc test de Dunn y Wilcoxon. Se consideró una significación estadística p<0.05 Resultados: Hay cambios importantes en la cinética de la contracción, particularmente la aparición de dos fases (una rápida y una lenta) en presencia de NaI. Sin embargo, no hay diferencias en el porcentaje máximo de la contracción al estimular con ATP en medio con NaCl y NaI, Los tres inhibidores no disminuyeron el porcentaje máximo de contracción, sin embargo, inmediata y rápidamente el vaso se relaja, afectando la mantención de la contracción en el tiempo. Conclusiones: Con los resultados obtenidos podemos decir que el Canal de Cloruro activado por Ca2+ (TMEM16A) es funcional en células musculares lisas de venas intrapulmonares pequeñas de ratas y participa en la contracción muscular inducida por ATP.

Introduction: The basic unit of smooth muscle is the smooth muscle cell. The regulation of contraction in the smooth muscle cell is through second messengers that open intracellular channels, present in the Endoplasmic Reticulum (ER), releasing calcium ions. Another route is through the entry of calcium from the extracellular medium through the activation of voltage-gated calcium channels (VDCC) generating

contraction. ATP is a physiological agonist that activates the Gq, Gs, and Gi protein- coupled purinergic receptors on the cell membrane. In our laboratory we have seen

that the contraction of the VIPs induced by ATP depends on the stimulation of the P2Y2/4 metabotropic receptors and the subsequent activation of phospholipase C beta (PCL-β), the production of inositol triphosphate (IP3), the activation of the inositol triphosphate receptor (IP3R), the release of Ca2+, therefore, an increase in the intracellular concentration of calcium [Ca2+]i and contraction. Chloride is the most abundant intracellular anion in vascular smooth muscle (VSMC) cells (~50 mM). Its activation requires the binding of 2 Ca2+ ions and an increase in Cl- permeability. As a result, the outward current of the chloride ion is produced, generating depolarization of the plasmatic membrane, activating the VDCCs, the entry of Ca2+, which favors the maintenance of contraction. Results of functional studies of contraction in VIP show that the contraction induced by KCl is inhibited between 78.5% for Nimodipine and 95.8% for Nicardipine. Surprisingly, ATP-induced contraction is also inhibited between 45.4% for Nitrendipine and 86.4% for Nimodipine. We postulate as a hypothesis that this inhibition by dihydropyridines (DHP) in contraction, when we use ATP, is observed due to the presence of TMEM16A-type Ca2+

-activated chloride channels that

depolarize the membrane and consequently activate VDCCs. Objective: To evaluate the participation of the Ca2+

-activated chloride channel (TMEM16A) in ATP-induced muscle contraction in smooth muscle cells of small intrapulmonary veins of rats. Methodology: Lung slices from male Sprague-Dawley rats (~430g) were obtained for studies of ATP-induced VIP vasoconstriction and inhibition in medium with NaI and with inhibitors such as Ani9, T16AinhAO1 and Benzbromarone (CBA1183 FMUCH Protocol). Shrinkage results are shown as the median ± S.E.M. The data were analyzed with the non-parametric Kruskal-Wallis test with the Dunn and Wilcoxon post hoc test. Statistical significance was considered p<0.05 Results: There are important changes in the contraction kinetics, particularly the appearance of two phases (one fast and one slow) in the presence of NaI. However, there are no differences in the maximum percentage of contraction when stimulating with ATP in the medium with NaCl and NaI. The three inhibitors did not decrease the maximum percentage of contraction; however, the vessel immediately and quickly relaxes, affecting the maintenance of contraction over time. Conclusions: With the results obtained, we can say that the Chloride Channel activated by Ca2+ (TMEM16A) is functional in smooth muscle cells of small intrapulmonary veins of rats and participates in ATP-induced muscle contraction.