Determinación de la carga parasitaria de Trypanosoma cruzi en ADN de sangre total y capa leucocitaria, mediante PCR cuantitativa en tiempo real, en individuos con Enfermedad de Chagas crónica

Abstract

INTRODUCCIÓN: A pesar de las mejoras en las herramientas diagnósticas para detección de Trypanosoma cruzi en muestras de sangre humana, y el uso de variadas metodologías descritas para la obtención y procesamiento de muestras, el aislamiento del parásito desde el torrente sanguíneo en la fase crónica de la enfermedad de Chagas (ECh) continúa siendo un desafío, debido a la dinámica de la parasitemia. Previo a la detección de ADN, existen variables como el volumen y fraccionamiento de la muestra, uso de anticoagulantes y/o preservantes, almacenamiento, incubación, entre otras, que pueden influir tanto en la concentración y pureza del ADN extraído, así como en el resultado de la carga parasitaria. Este estudio propone evaluar diferentes metodologías de obtención y procesamiento de muestras sanguíneas, para determinación de carga parasitaria de T. cruzi mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) en pacientes con ECh crónica. HIPÓTESIS: Las cargas parasitarias de T. cruzi determinadas mediante qPCR, en capa leucocitaria (CL) y sangre total mezclada con Guanidina-EDTA (GE) sin hervir, son mayores a la determinada en sangre en GE hervida, debido a las impurezas generadas en el proceso de calentamiento de esta última y a la mayor concentración parasitaria en capa leucocitaria resultante de la centrifugación. OBJETIVO: Comparar, mediante la aplicación de qPCR, la carga parasitaria circulante de T. cruzi en ADN extraído de muestras de sangre total mezclada con GE (hervida y no hervida) y en capa leucocitaria obtenida de individuos con ECh crónica. METODOLOGÍA: Se analizaron muestras de sangre periférica de 53 pacientes adultos confirmados serológicamente con ECh crónica y sin tratamiento etiológico, procedentes de la comuna de Combarbalá, Región de Coquimbo, Chile. Las muestras de sangre fueron recolectadas mediante una punción venosa y distribuidas en un tubo sin aditivos (para estudio serológico), un tubo con anticoagulante EDTA y un tubo con GE. Se separó la capa leucocitaria de las muestras en EDTA, mientras que las muestras de sangre en GE fueron divididas en alícuotas hervidas y no hervidas. Se realizó, bajo el mismo protocolo, extracción de ADN de las muestras de sangre en GE hervida, GE no hervida y capa leucocitaria. Mediante espectrofotometría se evaluó la concentración y pureza del ADN obtenido y, posteriormente, se aplicó el sistema qPCR-Taqman® para determinar la carga parasitaria de T. cruzi en los tres tipos de muestras. En el análisis estadístico se aplicó la prueba de t de Student para muestras pareadas y corrección de Bonferroni, chi cuadrado secuencial (χ2) y coeficiente de correlación de Spearman (rs). RESULTADOS: La concentración de ADN en la capa leucocitaria fue mayor al obtenido en muestras de sangre total en GE hervida y GE no hervida. El ADN de capa leucocitaria presentó mayor pureza que el ADN obtenido de sangre en GE hervida y GE no hervida a A260/280, mientras que a A260/230 no hubo diferencias significativas. Se detectó ADN parasitario circulante en muestras de 26 pacientes (49%), siendo 19 muestras positivas en GE hervida (35,8%), 17 en GE no hervida (32%) y 18 de CL (34%) (p=0,92). En 10 pacientes (18,9%), se detectó ADN parasitario tanto en GEH, GENH y CL y, en 7 de ellos (13,2%) fue posible cuantificar la parasitemia (≥ 0,1 par-eq/mL), existiendo una correlación positiva y significativa entre la concentración de ADN total y la carga parasitaria obtenida en las muestras, siendo más alta en capa leucocitaria (rs=0,96, p=0,002). CONCLUSIONES: Las bajas cargas parasitarias obtenidas en el presente estudio, continúan siendo un importante desafío para el diagnóstico parasitológico de la ECh crónica. No se evidenció diferencias significativas entre las parasitemias obtenidas en los tres tipos de muestras analizadas. Se estableció una correlación positiva y significativa entre la concentración de ADN total y la carga parasitaria obtenida en todos los tipos de muestras, siendo mayor en las muestras de capa leucocitaria.

INTRODUCTION: Despite improvements in diagnostic tools for the detection of Trypanosoma cruzi in human blood samples, and the use of several methodologies described for obtaining and processing samples, the isolation of the parasite from the bloodstream in the chronic phase of Chagas disease (ChD) continues to be a challenge, due to the parasitaemia dynamics. Prior to DNA detection, there are variables such as the volume and sample fractionation, use of anticoagulants and/or preservatives, storage, incubation, among others, that can influence both the concentration and purity of the extracted DNA, as well as the result of parasitic load. This study proposes to evaluate different methodologies for obtaining and processing blood samples, to determine the parasitic load of T. cruzi by real-time quantitative PCR (qPCR) in patients with chronic ChD. HYPOTHESIS: The parasitic loads of T. cruzi determined by qPCR, in buffy coat (BC) and whole blood mixed with Guanidine-EDTA (GE) without boiling, are greater than that determined in blood in boiled GE, due to the impurities generated in the heating process from the latter, and the highest parasitic concentration in the buffy coat resulting from centrifugation. OBJECTIVE: To compare, through the application of qPCR, the circulating parasitic load of T. cruzi in DNA extracted from samples of whole blood mixed with GE (boiled and non-boiled) and in buffy coat obtained from individuals with chronic ChD. METHODOLOGY: Peripheral blood samples from 53 serologically confirmed adult patients with chronic ChD and without etiological treatment, from the commune of Combarbalá, Coquimbo Region, Chile, were analyzed. Blood samples were collected by venipuncture and distributed in a tube without additives (for serological study), a tube with EDTA anticoagulant, and a tube with GE. Buffy coat was separated from EDTA samples, while GE blood samples were divided into boiled and non-boiled aliquots. Under the same protocol, DNA extraction was performed from blood samples in boiled GE, non-boiled GE and buffy coat. Using spectrophotometry, the concentration and purity of the DNA obtained was evaluated and, subsequently, the qPCR-Taqman® system was applied to determine the parasitic load of T. cruzi in the three types of samples. In the statistical analysis, the Student-t test for paired samples and Bonferroni correction, sequential chi square (χ2) and Spearman's correlation coefficient (rs) were applied. RESULTS: DNA concentration in the buffy coat was higher than that obtained in whole blood samples in boiled GE and non-boiled GE. Buffy coat DNA was higher in purity than DNA obtained from blood in boiled GE and non-boiled GE at A260/280, while at A260/230 there were no significant differences. Circulating parasitic DNA was detected in samples from 26 patients (49%), with 19 positive samples in boiled EG (35.8%), 17 in non-boiled EG (32%) and 18 in BC (34%) (p=0,92). In 10 patients (18.9%), parasitic DNA was detected in all GEH,

GENH and BC, and in 7 of them (13.2%) it was possible to quantify parasitaemia (≥ 0.1 par- eq/mL). There was a positive and significant correlation between DNA concentration and

parasite load obtained in the samples, being higher in the Buffy coat (rs=0,96, p= 0,002). CONCLUSIONS: The low parasite loads obtained in the present study continue to be an important challenge for the parasitological diagnosis of chronic ChD. Non-significant differences between the parasitemias obtained in the three types of samples analyzed were established. There was a positive and significant correlation between DNA concentration and parasite load obtained in all types of samples, being higher in buffy coat samples.