Expresión de variantes recombinantes de la citotoxina a (CagA) de helicobacter pylori en células derivadas de tumor gástrico humano

Abstract

La infección de la bacteria Helicobacter pylori es uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico (GC). Tanto así, que ha sido clasificado como un carcinogénico de grupo I por la OMS. Su prevalencia es alta a nivel mundial (∼50%), y aún más alta en Chile (∼75%), país donde el GC es la tercera causa de muerte por neoplasia y el país con mayor incidencia en la zona de Latinoamérica y el Caribe. Su asociación con el cáncer está altamente relacionada con la secreción de la proteína “Cytotoxic associated gen A” (CagA). CagA es una proteína polimórfica. Posee una región denominada “EPIYA”, que varía según la región geográfica. Si bien se conocen varios de los mecanismos mediante los cuales CagA está relacionada con la carcinogénesis, otros aún están sujetos a investigación. El objetivo de este trabajo es desarrollar sistemas de estudio in vitro de la patogenicidad de CagA y, particularmente, EPIYA mediante la expresión recombinante de variantes polimórifcas CagA en células derivadas del cáncer gástrico. Para ello, se amplificó el gen de CagA desde diversas cepas de referencia de Helicobacter pylori mediante PCR. Luego, se insertó en el sistema pF4 CMV Flexi Vector (Promega). pF4 es un vector que posee el promotor del Citomegalovirus humano, que permite la expresión transitoria en lineas celulares humanas. Los vectores recombinantes fueron modificados mediante mutagénesis sitio-dirigida para la generación de variantes que no poseen la región EPIYA. Los plásmidos fueron utilizados para la transfección de AGS, y se evaluó la expresión de CagA mediante inmunofluorescencia y WesternBlot. Los resultados no permiten aseverar una correcta expresión recombinante de la proteína, por lo que se propone secuenciar y modificar condiciones experimentales, tales como los anticuerpos utilizados y sus concentraciones. En el presente trabajo, se propusieron y desarrollaron metodologías que permiten la construcción de variantes polimórficas de CagA, para su expresión in vitro, incluyendo la generación de una variante de CagA poco estudiada, pertenecientes a ciertas poblaciones de nativos amerindios. Los sistemas de expresión construidos serán utilizados para el estudio de las carcinogénesis gástrica mediada por EPIYA.