The Role of Polyphosphate in Copper Resistance in Saccharolobus solfataricus

Abstract

Polyphosphates (polyP) are biopolymers composed of phosphate monomers linked by high-energy phosphoanhydride bonds. Found across all domains of life, polyP serve as energy sources, metal chelators, and play essential roles in stress defense. In Escherichia coli, polyP also functions as inorganic molecular chaperones. This study investigates whether polyP performs a similar chaperone role in archaea, using Saccharolobus solfataricus as a model organism. To explore this, polyP levels were quantified after exposure to varying copper concentrations, revealing a direct correlation between polyP degradation and metal concentration. At the minimum inhibitory concentration (MIC) of 2 mM Cu²⁺, polyP degradation stabilized 2 h post-exposure and did not recover after 24 h. ADP/ATP ratio analysis revealed notable differences between strains with and without polyP. Protein precipitation analysis under copper stress showed increased insoluble protein accumulation at higher copper concentrations, with significantly greater aggregation in the absence of polyP. Transcript levels were analyzed via qPCR to examine stress-related genes, including those for chaperones, chaperonins, copper resistance, oxidative stress response, and phosphate metabolism. All measured chaperonins showed increased transcript levels in the presence of polyP, whereas only some showed increased transcript levels in its absence. Interestingly, no increases of superoxide dismutase (sod) transcript levels were detected, suggesting oxidative stress may not play a primary role in the observed response. TMT-based quantitative proteomics identified proteins precipitated under copper stress in both the presence and absence of polyP, revealing distinct differences between the two conditions. While the isoelectric point of the precipitated proteins showed no significant influence, notable differences in amino acid composition were observed. Proteins precipitated under copper stress exhibited a higher cysteine content, suggesting that precipitation may result from direct interactions between copper and specific amino acids in protein structures, rather than from oxidative stress, as previously observed in E. coli. Additionally, the difference in the sets of proteins precipitated in the absence of polyP compared to those in its presence, combined with the higher glutamine content observed in proteins precipitated without polyP, suggests that polyP may exhibit a degree of specificity in protecting proteins enriched with glutamine residues. Overall, our findings highlight the critical role of polyP in mitigating copper stress in S. solfataricus, likely through its function as an inorganic chaperone. This protective role helps prevent protein aggregation and maintain cellular homeostasis under metal stress conditions, offering new insights into the mechanisms of metal resistance in archaea

Los polifosfatos (polyP) son biopolímeros compuestos por monómeros de fosfato unidos por enlaces de fosfoanhídrido de alta energía. Presentes en todos los dominios de la vida, los polyP actúan como fuentes de energía, quelantes de metales y desempeñan roles esenciales en la defensa contra el estrés. En Escherichia coli, los polyP también funcionan como chaperonas moleculares inorgánicas. Este estudio investiga si los polyP desempeñan un papel similar como chaperonas en arqueas, utilizando Saccharolobus solfataricus como organismo modelo. Para explorar esto, se cuantificaron los niveles de polyP después de la exposición a diferentes concentraciones de cobre, revelando una correlación directa entre la degradación de polyP y la concentración de metal. A la concentración mínima inhibitoria (MIC) de 2 mM de Cu²⁺, la degradación de polyP se estabilizó 2 h después de la exposición y no se recuperó, incluso tras 24 h. El análisis de la relación ADP/ATP mostró diferencias notables entre cepas con y sin polyP. El análisis de la precipitación de proteínas bajo estrés por cobre mostró un aumento en la acumulación de proteínas insolubles a concentraciones más altas de cobre, con una agregación significativamente mayor en ausencia de polyP. El análisis de los niveles de transcrito mediante qPCR examinó genes relacionados con el estrés, incluidos aquellos para chaperonas, chaperoninas, resistencia al cobre, respuesta al estrés oxidativo y metabolismo del fosfato. Todas las chaperoninas medidas se encontraron sobreexpresadas en presencia de polyP, mientras que solo algunas mostraron sobreexpresión en su ausencia. Curiosamente, no se detectó sobreexpresión de superóxido dismutasa (sod), lo que sugiere que el estrés oxidativo podría no ser el principal responsable de la respuesta observada. El análisis cuantitativo basado en proteómica TMT identificó proteínas precipitadas bajo estrés por cobre tanto en presencia como en ausencia de polyP, revelando diferencias significativas entre ambas condiciones. Aunque el punto isoeléctrico de las proteínas precipitadas no mostró una influencia notable, se observaron diferencias importantes en la composición de aminoácidos. Las proteínas precipitadas bajo estrés por cobre presentaron un mayor contenido de cisteína, lo que sugiere que la precipitación podría resultar de interacciones directas entre el cobre y aminoácidos específicos en las estructuras de las proteínas, más que del estrés oxidativo, como se observó previamente en E. coli. Además, la diferencia en los conjuntos de proteínas que precipitan en ausencia de polyP en comparación con las que lo hacen en su presencia, junto con el mayor contenido de glutamina observado en las proteínas que precipitan sin polyP, sugiere que los polyP podrían exhibir cierto grado de especificidad en la protección de proteínas enriquecidas con residuos de glutamina. En general, nuestros hallazgos resaltan el papel crítico de los polyP en la mitigación del estrés por cobre en S. solfataricus, probablemente a través de su función como chaperona inorgánica. Este papel protector ayuda a prevenir la agregación de proteínas y a mantener la homeostasis celular bajo condiciones de estrés por metales, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos de resistencia a metales en arqueas.