Diseño y evaluación de un sistema in situ para la producción simultánea de xilanasa y xilooligosacáridos en un cultivo de Pichia pastoris recombinante

Abstract

Los xilooligosacáridos (XOS) son prebióticos que pueden ser producidos por la hidrólisis enzimática de xilano con xilanasas. En general, se producen en un reactor con xilanasa bajo condiciones de pH y temperatura establecidas. Se postula que un sistema in situ, donde la producción de la enzima y la hidrólisis enzimática ocurren en el mismo reactor, podría ser más eficiente y económico. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema in situ para la producción enzimática de XOS. Se utilizó la levadura Pichia pastoris KM71 como microorganismo productor de la xilanasa, que secreta al medio de cultivo la xilanasa GtXyn10A del hongo Gloeophyllum trabeum en forma recombinante, bajo la inducción del promotor AOX1 por metanol. Como fuente de XOS se utilizó xilano de abedul. Se diseñó un medio de crecimiento de P. pastoris compatible con la actividad catalítica de la xilanasa GtXyn10A sobre xilano, utilizando extracto de levadura como única fuente de nitrógeno. El mejor medio para la fase de crecimiento de la levadura contenía extracto de levadura 2,4%, glicerol 1% y biotina 400 [μg/l], mientras que el medio de inducción tenía extracto de levadura 2,4%, metanol 0,5%, citrato de sodio 0,2 [M], pH 5, y 400 [μg/l] biotina. Además, se investigó la producción de XOS utilizando diferentes concentraciones de metanol y xilano, y se encontró que X2 fue el XOS más abundante, mientras que X3 se produjo en cantidades inferiores al 2,5%. La mayor producción de XOS fue 3,66 [mg/ml] a las 72 horas de cultivo con metanol al 1% y xilano al 1,2% en el medio. Se sugirió que se puede utilizar metanol al 0,5% en la inducción y se descubrió que a mayores concentraciones de xilano se favorecía una mayor producción de XOS. Se necesita más investigación para optimizar la producción de XOS a altas cargas de sustrato en el medio. En conclusión, se generó un sistema in situ para la producción de xilanasa recombinante y la hidrólisis de xilano en el mismo reactor. Experimentos a futuro deben dilucidar los factores que limitan la completa conversión de xilano a XOS, como inhibición o accesibilidad al sustrato, y estudiar la producción a altas cargas de xilano.

Xylooligosaccharides (XOS) are prebiotics that can be produced by enzymatic hydrolysis of xylan with xylanases. Typically, they are produced in a reactor with xylanase under established pH and temperature conditions. It is hypothesized that an in situ system, where enzyme production and enzymatic hydrolysis occur in the same reactor, could be more efficient and economical. The objective of this work was to develop an in situ system for the enzymatic production of XOS. The yeast Pichia pastoris KM71 was used as the xylanaseproducing microorganism, which secretes the GtXyn10A xylanase from the fungus Gloeophyllum trabeum into the culture medium in recombinant form, under the induction of the AOX1 promoter by methanol. Birch xylan was used as the source of XOS. A growth medium for P. pastoris was designed to be compatible with the catalytic activity of GtXyn10A xylanase on xylan, using yeast extract as the sole nitrogen source. The best medium for the yeast growth phase contained 2,4% yeast extract, 1% glycerol, and 400 [μg/l] biotin, while the induction medium contained 2,4% yeast extract, 0,5% methanol, 0,2 [M] sodium citrate, pH 5, and 400 [μg/l] biotin. Furthermore, XOS production was investigated using different concentrations of methanol and xylan, and it was found that X2 was the most abundant XOS, while X3 was produced in quantities of less than 2,5%. The highest XOS production was 3,66 [mg/ml] after 72 hours of cultivation with 1% methanol and 1,2% xylan in the medium. It was suggested that 0,5% methanol could be used for induction, and it was found that higher concentrations of xylan favored greater XOS production. Further research is needed to optimize XOS production at high substrate loads in the medium. In conclusion, an in situ system was developed for the production of recombinant xylanase and the hydrolysis of xylan in the same reactor. Future experiments should elucidate the factors limiting the complete conversion of xylan to XOS, such as inhibition or substrate accessibility, and investigate production at high xylan loads.