Identificación de residuos clave de la actividad HMP-fosfato quinasa en la familia de quinasas de vitaminas

Abstract

Las quinasas de vitaminas son fosfotransferasas dependientes de ATP, pertenecientes a la Superfamilia Riboquinasa, que participan en la biosíntesis de vitamina B1 y B6, fosforilando en general un grupo alcohol primario (R-OH) del sustrato. Específicamente, para la síntesis de vitamina B1, la fosforilación de 4-amino-5-hidroxi-2-metilpirimidina (HMP) a 4-amino-5- hidroximetil-2-metilpirimidina fosfato (HMP-P) es catalizada por una enzima de la familia, el producto del gen thiD (proteína ThiD-HMPPK), que además de catalizar la fosforilación de HMP a HMP-P, realiza la posterior fosforilación del intermediario HMP-P, a 4-amino-5-hidroximetil-2- metilpirimidina pirofosfato (HMP-PP). En particular, esta actividad es única en esta superfamilia de enzimas, ya que involucra la transferencia de un grupo fosfato del ATP a un grupo metileno fosfato en el HMP-P, reacción para la cual se desconoce el mecanismo catalítico y los residuos claves para la catálisis. Recientemente en nuestro laboratorio se cristalizó y se determinó la estructura de una enzima ThiD-HMPPK ancestral del orden Enterobacteriales (denominado AncEn) en presencia de los ligandos HMP, HMP-P y análogos no hidrolizables de ATP o ADP. Estos complejos permitieron identificar aminoácidos que interactúan directamente con los sustratos, encontrándose que en el complejo AncEn/MgATP/HMP-P la Histidina-179 y la Treonina-211 reorientan sus cadenas laterales en dirección de la molécula de ATP, respecto al complejo AncEn/MgATP/HMP. En base a esta información, se propuso que dichos residuos podrían ser claves en la estabilización de los grupos fosfatos del ATP, participando directamente en el mecanismo catalítico de la fosforilación de HMP-P en las enzimas ThiD-HMPPK. Para corroborar esta hipótesis y evaluar la función de los aminoácidos Histidina-179 y Treonina 211 del AncEn en la actividad HMP-P quinasa, se realizó un reemplazo simple y doble de estos residuos por alanina (mutantes AncEnH179A, AncEnT211A y AncEnH179A/T211A) mediante la técnica de mutagénesis sitio-dirigida. La posterior caracterización cinética mostró una caída de 14 y 20 veces en la kcat en los ensayos con HMP-P para las mutantes simples AncEnH179A y AncEnT211A , en comparación con la enzima silvestre, y la supresión total de su actividad con HMP-P en la doble mutante. La actividad con HMP, sin embargo, no se vio significativamente alterada en ninguna mutante. Asimismo, se realizaron simulaciones de Dinámica Molecular para analizar la interacción de estos residuos con los ligandos. Un análisis de MM-PBSA mostró que la contribución energética de los residuos Histidina-179 y Treonina-211 en la unión de ATP es mayor en el sistema con HMP-P, en comparación con el sistema en presencia HMP. De igual manera, la energía de unión total de los ligandos en el sistema con HMP-P es más favorable en el caso de la enzima silvestre, respecto de las mutante AncEnH179A/T211A, mientras que la energía de unión de la doble mutante en el sistema con HMP resulta prácticamente idéntico a la proteína silvestre. Estos resultados demuestran que los residuos Histidina-179 y Treonina-211 son cruciales para la fosforilación de HMP-P, pero no para la fosforilación de HMP en la proteína ancestral AncEn y sugieren que serían claves para la fosforilación de HMP-P en todas las enzimas ThiD-HMPPK de la familia.

Vitamin kinases are ATP-dependent phosphotransferases, belonging to the Ribokinase Superfamily, which are involved in the biosynthesis of vitamin B1 and B6, generally by phosphorylating a primary alcohol group (R-OH) of the substrate. Specifically, for vitamin B1 synthesis, the phosphorylation of 4-amino-5-hydroxy-2-methylpyrimidine (HMP) to 4-amino-5- hydroxymethyl-2-methylpyrimidine phosphate (HMP-P), is catalyzed by an enzyme of the family, the product of the thiD gene (ThiD-HMPPK protein), which besides the phosphorylation of HMP to HMP-P, performs the subsequent phosphorylation of the HMP-P intermediate to 4- amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine pyrophosphate (HMP-PP). This activity is unique in this enzyme superfamily, as it involves the transfer of a phosphate group from ATP to a methylene phosphate group on HMP-P, a reaction for which the catalytic mechanism and the key residues for catalysis are unknown. Recently in our laboratory, the structure of an ancestral ThiD-HMPPK enzyme of the order Enterobacteriales (named AncEn) was determined in the presence of the ligands HMP, HMP-P and non-hydrolysable analogues of ATP or ADP. These complexes allowed the identification of amino acids that interact directly with the substrates, revealing that in the AncEn/MgATP/HMP-P complex, Histidine-179 and Threonine-211 residues reorient their side chains in the direction of the ATP molecule, with respect to the AncEn/MgATP/HMP complex. Based on this information, it was proposed that these residues could be key in the stabilization of ATP phosphate groups by directly participating in the catalytic mechanism of HMP-P phosphorylation in ThiD-HMPPK enzymes. To corroborate this hypothesis and to assess the role of the Histidine-179 and Threonine-211 residues of AncEn in its HMP-P kinase activity, single and double replacement of these residues by alanine (AncEnH179A, AncEnT211A and AncEnH179A/T211A mutants) was performed by site directed mutagenesis. Subsequent kinetic characterization showed a 14- and 20-fold diminution in the kcat in HMP-P assays for the single mutants AncEnH179A and AncEnT211A, compared to the wild-type enzyme, and total suppression of its activity with HMP-P in the double mutant. HMP activity, however, was not significantly altered in any mutant. Molecular Dynamics simulations were also performed to analyze the interaction of these residues with ligands. An MM-PBSA analysis showed that the energetic contribution of the Histidine-179 and Threonine-211 residues in ATP binding is higher in the HMP-P system compared to the system in the presence of HMP. Similarly, the total binding energy of the ligands in the HMP-P system is more favorable in the case of the wild-type enzyme compared to the AncEnH179A/T211A mutants, while the binding energy of the double mutant in the HMP system is almost identical to that of the wild-type protein. These results demonstrate that in the ancestral AncEn protein residues Histidine-179 and Threonine-211 are crucial for the phosphorylation of HMP-P, but not for HMP phosphorylation and suggest that they are crucial for HMP-P phosphorylation in all the ThiD-HMPPK family enzymes