Desarrollo de enzimas de extremófilos para la degradación de ácido poliláctico (PLA)

Abstract

El presente informe presenta la caracterización, transformación, purificación y evaluación de la actividad enzimática (esterasa y PLAsa) de proteínas recombinantes, enfocándose principalmente en las enzimas CH54 y LN32, que tienen potencial para degradar PLA. Inicialmente, se analizaron las secuencias aminoacídicas de cuatro proteínas (CH54, LN32, CH82 y LH23) y se realizó un BLAST para confirmar su identidad, determinándose propiedades como el peso molecular, el número de aminoácidos y el punto isoeléctrico, lo que permitió identificar a CH54 y LN32 como candidatas para romper enlaces éster. Posteriormente, se transformaron cepas de E. coli (DH5α y NiCo21) con los plásmidos correspondientes, obteniéndose colonias en medio con ampicilina que confirmaron el éxito de la transformación y la expresión de las proteínas recombinantes.

El proceso de purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad (IMAC) utilizando gradientes de imidazol, aunque en los cromatogramas se observaron múltiples peaks debido a la coelución de proteínas nativas de E. coli que también presentan afinidad por la columna. El análisis mediante SDS-PAGE permitió identificar bandas correspondientes a la proteína de interés, en particular, se detectaron bandas alrededor de 42 kDa para CH54, lo cual no coincidió con el peso teórico, pero posteriormente se confirmó que se trataba de la proteína recombinante con los ensayos de actividad. Los ensayos cinéticos utilizando p-nitrofenil butirato como sustrato confirmaron que las fracciones más puras de CH54 y LN32 presentan una actividad esterasa significativa, aumentando esta actividad a temperaturas elevadas, en particular a 70°C.

Se evaluó la capacidad PLAsa de las enzimas mediante ensayos para cuantificar la liberación de ácido láctico con un kit comercial y HPLC, aunque estos métodos no lograron detectar concentraciones relevantes, posiblemente por sus límites de detección. Por su parte, el análisis mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró diferencias morfológicas en el sustrato, mientras que los controles negativos (PLA en buffer y agua) presentaron superficies lisas con algunas grietas atribuibles a la incubación a alta temperatura, el control positivo con proteinasa K evidenció una erosión más marcada y CH54 mostró una degradación más extensa del PLA en comparación con LN32. Estos resultados sugieren que, si bien ambas enzimas tienen la capacidad de degradar PLA, CH54 resulta ser más efectiva, lo que destaca la necesidad de optimizar las condiciones de purificación y los métodos analíticos para obtener resultados más comparables en futuros estudios.