Estudio bioinformático y clonamiento de Pectato Liasa (PL) de calafate (Berberis microphylla) en levadura Pichia pastoris

Abstract

El calafate (Berberis microphylla) es fruto endémico de la Patagonia chilena y destaca por su alto contenido de polifenoles, su capacidad antioxidante y su adaptabilidad a ambientes extremos, lo que lo convierte en un modelo atractivo para aplicaciones biotecnológicas. En este contexto, el proyecto Anillo "CHIlean fruits cell wall COmponents as BIOtechnological resources" (CHICOBIO) busca desarrollar estrategias biotecnológicas que permitan transformar residuos de la agroindustria chilena en productos de valor agregado, mediante el uso de enzimas robustas provenientes de frutas nativas como el calafate. Una de estas enzimas es la pectato liasa (PL), que cataliza la despolimerización de pectinas presentes en la pared celular vegetal, facilitando su degradación y posterior aprovechamiento. En este trabajo se abordó el análisis bioinformático y clonamiento del coding sequence (CDS) de PL de calafate (BmPL) para ser expresada en el sistema heterólogo Pichia pastoris, conocido por ser un buen modelo para permitir la expresión inducida de proteínas heterólogas a gran escala. Estos esfuerzos se utilizarán para su futura purificación y caracterización para avanzar hacia su aplicación en la digestión enzimática de residuos agroindustriales. El CDS de BmPL fue identificado previamente mediante análisis bioinformáticos a partir del transcriptoma de calafate. En este seminario de título se realizó la predicción de su estructura tridimensional utilizando AlphaFold. Para la evaluación de su estructura y sitio activo se comparó con pectato liasas de otras especies vegetales (Arabidopsis thaliana y Solanum lycopersicum) y una enzima bacteriana bien caracterizada (PelC de Erwinia chrysanthemi, también llamada Dickeya dadantii). Para el clonamiento del CDS de BmPL se realizaron extracciones de ARN a partir de fruto y hoja de calafate. No se pudo obtener ARN de calidad desde frutos debido a su alto contenido de compuestos fenólicos; sin embargo, se logró obtener ARN de alta calidad a partir de hojas. Se clonó el CDS de BmPL extraído desde hojas de calafate y se comparó su secuencia nucleotídica con un clon previo de BmPL en pGEM-T Easy. Dado que ambas secuencias tenían los mismos cambios de bases respecto del transcriptoma de referencia, se procedió con el clonamiento de BmPL de fruto en el vector de expresión pPICZαA. El constructo pPICZαA-BmPL fue verificado por análisis moleculares, luego fue linealizado con SacI con el fin de transformar células electrocompetentes de P. pastoris. Las colonias transformantes fueron seleccionadas en medio YPDS con Zeocina y la integración del gen se confirmó mediante PCR en ADN genómico. Este trabajo constituye un avance importante en la construcción de un sistema de expresión heteróloga para BmPL, alineado con los objetivos del proyecto CHICOBIO, que busca valorizar residuos agroindustriales mediante la acción de enzimas nativas con potencial biotecnológico.

Calafate (Berberis microphylla) is an endemic berry from Chilean Patagonia, notable for its high polyphenol content, antioxidant capacity, and adaptability to extreme environments, making it an attractive model for biotechnological applications. In this context, the Anillo project "CHIlean fruits cell wall COmponents as BIOtechnological resources" (CHICOBIO) aims to develop biotechnological strategies to transform Chilean agro-industrial waste into value-added products using robust enzymes from native fruits such as calafate. One of these enzymes is pectate lyase (PL), which catalyzes the depolymerization of pectins present in the plant cell wall, facilitating its degradation and subsequent utilization. This work focused on the bioinformatic analysis and cloning of the coding sequence (CDS) of PL from calafate (BmPL) to be expressed in the heterologous system Pichia pastoris, known for being a good model to allow the induced expression of heterologous proteins on a large scale. These efforts will be used for its future purification and characterization to advance its application in the enzymatic digestion of agro industrial waste. The BmPL CDS was previously identified through bioinformatic analyses from the calafate transcriptome. In this degree seminar, its three-dimensional structure was predicted using AlphaFold. To evaluate its structure and active site, it was compared with pectate lyases from other plant species (Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum) and a well characterized bacterial enzyme (PelC from Erwinia chrysanthemi, also called Dickeya dadantii). For the cloning of the BmPL CDS, RNA extractions were performed from calafate fruit and leaf. High-quality RNA could not be obtained from fruits due to their high content of phenolic compounds; however, high-quality RNA was successfully obtained from leaves. The BmPL CDS extracted from calafate leaves was cloned and its nucleotide sequence was compared with a previous BmPL clone in pGEM-T Easy. Given that both sequences had the same base changes with respect to the reference transcriptome, the cloning of BmPL from fruit into the expression vector pPICZαA was carried out. The pPICZαA-BmPL construct was verified by molecular analyses and then linearized with SacI for the transformation of electrocompetent P. pastoris cells. Transformant colonies were selected on YPDS medium with Zeocin, and gene integration was confirmed by PCR on genomic DNA. This work represents a significant advance in the construction of a heterologous expression system for BmPL, aligned with the objectives of the CHICOBIO project, which seeks to valorize agroindustrial waste through the action of native enzymes with biotechnological potential.