Caracterización bioquímica y estructural de la enzima trifuncional ThiDN de la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus

Abstract

Los organismos extremófilos tienen la capacidad de vivir y desarrollarse en condiciones ambientales que exceden los límites fisiológicos tolerables para la mayoría de los seres vivos. Existen distintos tipos de extremófilos según el ambiente en que se desarrollan, sus características metabólicas y genéticas. A nivel industrial, estas propiedades son de interés para el desarrollo de procesos químicos que requieren de condiciones extremas similares a las del entorno de crecimiento de estos microorganismos. En este contexto, las extremozimas, enzimas derivadas de organismos extremófilos, surgen como una alternativa prometedora para la necesidad industrial de biocatalizadores altamente eficientes bajo dichas condiciones. Dentro de los tres dominios de la vida, la vitamina B1 o tiamina pirofosfato (THI-PP) actúa como un cofactor esencial en diversos procesos metabólicos. Su síntesis implica la condensación de dos sustratos: 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina pirofosfato (HMP-PP) y 4-metil-5-β hidroxietiltiazol fosfato (THZ-P), catalizada por enzimas con actividad tiamina fosfato sintasa (TPS), produciendo tiamina fosfato (THI-P), pirofosfato (PPi) y CO2. Posteriormente, THI-P es fosforilada para formar THI-PP, su forma biológicamente activa. Sin embargo, la vía de síntesis de THI-P en arqueas aún no está completamente descrita. Se ha propuesto que en estos organismos la actividad TPS es llevada a cabo por una enzima del tipo ThiN, análoga a la proteína ThiE en bacterias. Curiosamente, el grupo de proteínas ThiN en arqueas se encuentra fusionado con un dominio ThiD, que presentaría las actividades quinasas dependiente de ATP 4-amino-5- hidroximetil-2-metilpirimidina (HMP) quinasa y 4-amino-5-hidroximetil-2-metilpirimidina fosfato (HMP-P) quinasa (actividad HMPK/HMPPK) que llevarían a la síntesis de HMP-PP, formando una proteína multidominio trifuncional denominada ThiDN. En este seminario de título se llevó a cabo la caracterización de la enzima ThiDN de la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus. Para ello, se diseñó un ensayo enzimático acoplado utilizando una enzima glucoquinasa dependiente de ADP preveniente de la arquea hipertemófila Thermococcus litoralis (TlGK) y una glucosa-6-fosfatos deshidrogenasa dependiente de NADP+ derivada de la bacteria termófila Thermotoga marítima (TmG6PDH). Esto permitió medir la actividad HMPK/HMPPK del dominio ThiD de PfThiDN en un rango de temperatura entre 40 y 90°C, seguido de su caracterización cinética mediante la determinación de los valores de KM y Vmax. Asimismo, se evaluó la actividad TPS de la enzima bajo condiciones termófilas mediante un ensayo discontinuo de detección de PPi. Se generaron curvas de progreso a diferentes concentraciones de enzima, observándose un aumento en la cantidad de PPi con el tiempo y una correlación con la concentración enzimática. No obstante, la temporalidad en que se desarrolla la reacción (horas), difiere de los observado para otras enzimas homólogas a PfThiDN. Además, mediante cristalografía de rayos X, se resolvió la estructura de PfThiDN, evidenciando la organización de ambos dominios y su conexión estructural. En esta estructura, el dominio ThiD se encontraba en un estado ternario junto con los productos de la primera fosforilación de las actividades quinasa (HMPK). Complementariamente, se realizó un análisis del estado de oligomerización a partir de la simetría cristalográfica de la celda unitaria, lo que sugirió que PfThiDN podría encontrarse como dímero o tetrámero en solución. Finalmente, para determinar el estado de oligomerización de PfThiDN, se emplearon técnicas analíticas y biofísicas como cromatografía de exclusión molar, dispersión dinámica de la luz y SAXS. Los resultados indicaron que PfThiDN adopta un estado oligomérico tetramérico. Este hallazgo representa la primera vez que se reporta una estructura oligomérica de este tipo en la literatura, respaldado por la dimerización de los dominios ThiN y ThiD.

Extremophilic organisms have the ability to live and thrive in environmental conditions that exceed the physiological limits tolerable for most living organisms. There are different types of extremophiles depending on the environment in which they develop and their metabolic and genetic characteristics. At the industrial level, these properties are of interest for developing chemical processes that require extreme conditions like those found in the native habitats of these microorganisms. In this context, extremozymes, enzymes derived from extremophilic organisms, emerge as a promising alternative to meet the industrial demand for highly efficient biocatalysts under such conditions. Across the three domains of life, vitamin B1, or thiamine pyrophosphate (THI-PP), functions as an essential cofactor in various metabolic processes. Its biosynthesis involves the condensation of two substrates: 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine pyrophosphate (HMP-PP) and 4- methyl-5-β-hydroxyethylthiazole phosphate (THZ-P), catalyzed by enzymes with thiamine phosphate synthase (TPS) activity, producing thiamine phosphate (THI-P), pyrophosphate (PPi), and CO₂. THI-P is subsequently phosphorylated to form THI-PP, its biologically active form. However, the biosynthetic pathway of THI-P in archaea remains incompletely described. It has been proposed that, in these organisms, TPS activity is carried out by a ThiN-type enzyme, analogous to the ThiE protein in bacteria. Interestingly, in archaea, ThiN proteins are fused with a ThiD domain, which is believed to exhibit ATP-dependent 4-amino-5-hydroxymethyl-2- methylpyrimidine (HMP) kinase and 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine phosphate (HMP-P) kinase activity (HMPK/HMPPK), leading to the synthesis of HMP-PP. This fusion results in a trifunctional multidomain protein known as ThiDN. This thesis seminar addressed the characterization of the ThiDN enzyme from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. For this, a coupled enzymatic assay was designed using an ADP-dependent glucokinase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus litoralis (TlGK) and a NADP⁺-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from the thermophilic bacterium Thermotoga maritima (TmG6PDH). This allowed measurement of the HMPK/HMPPK activity of the ThiD domain of PfThiDN across a temperature range of 40 to 90°C, followed by kinetic characterization by determining KM and Vmax values. Additionally, TPS activity was evaluated under thermophilic conditions using a discontinuous assay for pyrophosphate (PPi) detection. Progress curves at varying enzyme concentrations showed increased PPi production over time, correlating with enzyme concentration. However, the timescale of the reaction (several hours) differed from that observed for other PfThiDN homologous enzymes. Furthermore, through X-ray crystallography, the structure of PfThiDN was solved, revealing the organization and structural connection of both domains. In this structure, the ThiD domain was found in a ternary complex with the products of the first kinase phosphorylation reaction (HMPK). Complementary analysis of the oligomeric state based on the crystallographic symmetry of the unit cell suggested that PfThiDN may exist as a dimer or tetramer in solution. Finally, to determine the oligomeric state of PfThiDN, analytical and biophysical techniques such as size-exclusion chromatography, dynamic light scattering (DLS), and small-angle X-ray scattering (SAXS) were employed. The results indicated that PfThiDN adopts a tetrameric oligomeric state. This finding represents the first report of such an oligomeric structure in the literature, supported by dimerization of both the ThiN and ThiD domains.