Caracterización del rol fotomorfogénico de DcHY5 en Nicotiana tabacum

Abstract

La fotomorfogénesis es el proceso que permite el desarrollo de las plantas por efecto de la luz. Se aprecia en ésta la aparición de hojas verdaderas y la síntesis de pigmentos tales como la clorofila y los carotenoides. Estos últimos son pigmentos liposolubles que participan en la fotosíntesis, tienen funciones de fotoprotección y además otorgan colores como el amarillo, naranja y rojo a flores y frutas. Su biosíntesis inicia por la reacción catalizada por la enzima fitoeno sintasa (PSY) y en la que participan otras 10 enzimas. Entre los mecanismos de regulación de esta ruta se encuentra el factor de transcripción Elongated Hypocotyl 5 (HY5), de la familia b-zip de cremalleras de leucina, el cual es un regulador maestro de la fotomorfogénesis, siendo capaz de unirse al promotor de PSY en Arabidopsis thaliana crecidas en luz lo que aumenta la síntesis de carotenoides. Daucus carota (la zanahoria) es un interesante modelo de la fotomorfogénesis, dado que acumula carotenoides en su raíz de reserva que crece bajo el suelo, pero cuyos mecanismos que regulan su síntesis no están del todo descritos. Dado esto, se propone dilucidar si DcHY5 posee un rol como regulador transcripcional en la síntesis de carotenoides en la raíz de reserva de zanahoria. En trabajos previos hemos determinado que DcHY5 posee localización nuclear, se une al promotor del gen DcPSY1 y es capaz de transactivar dicho promotor. Con el objetivo de profundizar en la caracterización funcional de DcHY5, en este seminario de título se realizó el análisis bioinformático de tanto la zona promotora de DcHY5, sugiriendo que su regulación transcripcional responde principalmente a motivos asociados a la respuesta por luz (25% de los motivos) y a la respuesta por hormonas (31% de los motivos). También se realizó un análisis de coexpresión de HY5 el cual sugiere que este coexpresa principalmente con factores que lo regulan de manera negativa como COP1, BBX24 y BBX25, además de su homólogo HYH. También se obtuvieron líneas de Nicotiana tabacum sobreexpresoras de DcHY5 T0 mediante organogénesis somática, su cultivo y posterior traspaso a tierra. En estas líneas transgénicas determinamos que aumenta tanto la concentración de clorofila como la de carotenoides, a pesar de que uno de los genes NtPSY se mantiene estable en expresión mientras que el otro disminuye. Adicionalmente, se determinó una disminución de la transcripción NtCOP1 dependiente del nivel de sobreexpresión de DcHY5, sugiriendo la presencia de un mecanismo de represión de NtCOP1 activado por DcHY5. Nuestros resultados permiten concluir que DcHY5 posee un rol positivo en la fotomorfogénesis de N. tabacum al promover la síntesis de carotenoides y clorofilas y al generar una retroalimentación negativa bidireccional con su represor COP1.

Photomorphogenesis is the process that allows the development of plants by the effect of light. It is seen in the appearance of true leaves, and the synthesis of pigments such as chlorophyll and carotenoids. The latter are liposoluble pigments that participate in photosynthesis, have photoprotection functions and provide yellow, orange and red colors to flowers and fruits. Their biosynthesis started by the reaction catalyzed by the enzyme phytoene synthase (PSY), in which 10 other enzymes participate. Among the regulatory mechanisms of this pathway in A. thaliana is the transcription factor Elongated Hypocotyl 5 (HY5), of the b-zip family of leucine zippers, which is a master regulator of photomorphogenesis, being able to bind to the PSY promoter in light-grown Arabidopsis, increasing carotenoid synthesis. Daucus carota (carrot) is an interesting model, since it accumulates carotenoids in its reserve root growing under the soil, but the mechanisms regulating their synthesis have not been fully described. Given this, we propose to elucidate whether DcHY5 has a role as a transcriptional regulator in carotenoid synthesis in the carrot taproot. In previous works we have determined that DcHY5 has nuclear localization, binds to the promoter of the DcPSY1 gene and is able to transactivate this promoter. In order to deepen the functional characterization of DcHY5, in this title seminar we performed a bioinformatic analysis of the promoter of DcHY5, suggesting that its transcriptional regulation responds mainly to motifs associated with light (25% of the motifs) and to hormones (31% of the motifs). Coexpression analysis of HY5 was also performed, suggesting that it coexpresses mainly with down-regulating factors such as COP1, BBX24 and BBX25, in addition to its homolog HYH. DcHY5 T0 overexpressing lines of Nicotiana tabacum were also obtained by somatic organogenesis, cultivation and subsequent transfer to greenhouse. In these transgenic lines, we determined that both chlorophyll and carotenoid concentrations increased, although one of the NtPSY genes remained stable in expression while the other decreased. Additionally, we determined a decrease in NtCOP1 transcription dependent on the level of DcHY5 overexpression, suggesting the presence of a DcHY5-activated NtCOP1 repression mechanism. Our results allow us to conclude that DcHY5 has a positive role in N. tabacum photomorphogenesis by promoting carotenoid and chlorophyll synthesis and by generating bidirectional negative feedback with its repressor COP1.