Diseño de variantes de la hidrolasa termófila LCC con alta eficiencia de degradación de PET a temperatura ambiente mediante Inteligencia Artificial

Abstract

En el campo de la degradación enzimática del tereftalato de polietileno (PET), la proteína con mayor actividad PET-hidrolasa corresponde a la enzima termófila LCC (PDB ID 4EB0), pero la eficiencia en su actividad está supeditada a las altas temperaturas de reacción. Este factor incide en la escalabilidad y costo del proceso. Por lo tanto, la obtención de enzimas que sean capaces de degradar el PET a temperaturas mesófilas es crucial para la reducción de costos asociados a la degradación enzimática de este desecho. En el presente trabajo se propone una estrategia para el diseño de variantes de la enzima LCC, mediante en la utilización de modelos computacionales basados en Deep-Learning, con el objetivo de obtener variantes con actividad a temperaturas mesófilas con respecto a la enzima silvestre. La expresión de las enzimas de interés se llevaron a cabo de manera extracelular, no obstante, dado el bajo rendimiento se optó por la expresión intracelular de estas. Derivadas del flujo de trabajo, 2 enzimas mutantes mostraron actividad contra el polímero análogo al PET, PCL, a temperaturas de entre 20-30°C las cuales fueron posteriormente caracterizadas. Finalmente, para determinar los efectos de las mutaciones puntuales a nivel estructural, se realizaron análisis por Dinámica Molecular en donde no se registraron cambios significativos entre las mutantes con respecto a la silvestre.

In the degradation of polyethylene terephthalate (PET) using enzymes field, the enzyme showing the highest activity against this polymer is the thermophile enzyme LCC, but its high activity is subjected to the high temperatures required for the reaction to occur. This factor has negative effects on the scalability and cost-effectiveness of the process. Thus, the obtention of enzymes capable of breaking down PET at mesophilic temperatures becomes crucial for cost reduction associated with the enzymatic degradation of plastics. This work proposes a new pipe-line for the design of new variants of the thermophile enzyme LCC, using Deep Learning computational models for the obtention of mesophilic candidates compared to the wild-type. First, the expression of these enzymes was targeted to the extracellular space but, due to the low yield of the purifications, the strategy was switched to intracellular expression. As a result of the proposed workflow, 2 mutant enzymes showed activity against PCL at low temperatures ranging from 20- 30 °C and were further characterized. Lastly, to assess the structural effects of the point mutations, Molecular Dynamics analysis was implemented but no significant differences were reported for the RMSF (Å) values between the mutants and the wild-type.