Evaluation of the role of the polyketide synthase encoded by the gymC gene on the specialized metabolism of the Antarctic filamentous fungus Pseudogymnoascus verrucosus

Abstract

The Antarctic fungus Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 produces N-acetylanthranilic acid (N-AAA), an acetylated derivate of anthranilic acid occasionally detected in microbial specialized metabolism. Although its biosynthetic pathway has not been elucidated in fungi, in P. verrucosus FAE27it was preliminarily linked to the polyketide synthase (PKS) gene gymC. This thesis aimed to validate this hypothesis using CRISPR/Cas9 gene editing. A comprehensive bioinformatic analysis of the GymC cluster was performed, gene disruption vectors were constructed, and a collection of transformants was generated while optimizing key protocols to improve efficiency and cost-effectiveness. The effect of gymC inactivation was evaluated by comparative HPLC analysis. Bioinformatic analysis predicted that gymC encodes a complex polyketide, which is inconsistent with the structure of N-AAA. Experimentally, the inactivation of gymC did not affect N-AAA production, thus conclusively refuting the initial hypothesis. Instead, a critical physiological factor was uncovered: N-AAA production is strongly influenced by culture morphology (rheology), decreasing drastically in pellet-forming cultures. Furthermore, an exploratory metabolite profiling in PDB and YES media revealed new candidate metabolites whose production is affected by the gymC mutation and whose spectral features are consistent with the bioinformatic prediction. In conclusion, this work refutes a previous hypothesis, identifies culture rheology effect as a crucial experimental artifact, establishes an optimized genetic platform for a non-model fungus, and provides the first candidates and a basis for elucidating the true function of the GymC cluster.

El hongo antártico Pseudogymnoascus verrucosus FAE27 produce ácido N-acetilantranílico (N-AAA), un derivado acetilado del ácido antranílico que ha sido ocasionalmente detectado en el metabolismo especializado microbiano. Aunque su ruta biosintética no ha sido aún dilucidada en hongos, en P. verrucosus ha sido preliminarmente asociada al gen de la policétido sintasa (PKS) gymC. Esta tesis tuvo como objetivo validar dicha hipótesis mediante edición genética mediada por CRISPR/Cas9. Para ello, se realizó un análisis bioinformático exhaustivo del clúster GymC, se construyeron vectores de disrupción génica y se generó una colección de transformantes, optimizando en el proceso protocolos clave para incrementar su eficiencia y reducir costos. El efecto de la inactivación de gymC fue evaluado mediante análisis comparativo por HPLC. El análisis bioinformático predijo que gymC codifica para un policétido complejo, incongruente con la estructura del N-AAA. Experimentalmente, la inactivación de gymC no afectó la producción de N-AAA, refutando de manera concluyente la hipótesis inicial. En su lugar, se descubrió un factor fisiológico crítico: la producción de N-AAA está fuertemente influenciada por la morfología del cultivo (reología), disminuyendo drásticamente en cultivos que forman pellets. Adicionalmente, un análisis exploratorio del perfil metabólico en medios PDB y YES reveló nuevos metabolitos candidatos cuya producción sí es afectada por la mutación de gymC y cuyas características espectrales son consistentes con la predicción bioinformática. En conclusión, este trabajo refuta una hipótesis previa, identifica la reología del cultivo como un artefacto experimental crucial, establece una plataforma genética optimizada para un hongo no-modelo y proporciona los primeros candidatos y una base para la elucidación de la verdadera función del clúster GymC.