Las moléculas HLA-DR que expresan alelos del epítopo compartido, favorecen la presentación de péptidos de alta afinidad derivados de proteínas en tejido y fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide

Abstract

Estudiamos el peptidoma asociado a la molécula HLA-DR, tanto en tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (AR) como en células dendríticas (CD) de donantes positivos para alelos del epítopo compartido (EC), pulsadas con fluido sinovial de pacientes AR. Estos alelos han sido extensamente estudiados, encontrándose una asociación con AR. Nosotros mediante el uso de espectrometría de masa describimos el repertorio peptídico de algunos alelos del EC, obtenidos desde tejido y CDs de donantes sanos pulsados con FS. Basándonos en el tipo de unión de estas secuencias peptídicas y su procedencia, logramos ver características propias de estos alelos, que presentaban un tipo de unión teórica más afín a las secuencias peptídicas. Esto nos permitirá en un futuro cercano el desarrollo de una búsqueda de posibles nuevos auto- antígenos para esta enfermedad. Metodología: Se seleccionaron 3 pacientes con AR para cirugía de reemplazo articular, los cuales se genotipificaron para el gen HLA-DR y de los cuales se obtuvo fluido y tejido sinovial. Además, se reclutaron 100 donantes sanos en busca de donantes positivos para los alelos del EC. De los donantes seleccionados se generaron CD, las que fueron pulsadas con fluido sinovial de pacientes AR. Se aislaron complejos HLA-DR/péptidos desde tejido sinovial y CD pulsadas y no pulsadas, y posteriormente se eluyeron los péptidos, los que fueron secuenciados por espectrometría de masas y analizados por herramientas bioinformáticas. Resultados: Se obtuvieron 1176 péptidos, provenientes de 227 proteínas. La mayoría de los péptidos fueron presentados en “nested set” y derivaban de proteínas procesadas por la vía endocítica. En el caso de tejido sinovial, la mayoría de los péptidos provenía del medio extracelular, mientras que en las CD, los péptidos provenían en un 70% de membrana plasmática. Los alelos del EC DRB1*01:01 y DRB1*04:01 presentaron en tejido una mayor cantidad de péptidos de afinidad alta e intermedia por las respectivas moléculas HLA-DR. En las CD los péptidos presentados en el alelo DRB1*01:01 tenían una afinidad teórica alta por ésta molécula. No se observó la presentación de péptidos citrulinados en tejido sinovial ni en CD pulsadas y no pulsadas. Conclusión: El peptidoma proveniente de CD cargadas con fluido sinovial de pacientes AR o de tejido sinovial de pacientes AR presentado por moléculas HLA-DR positivas para los alelos EC, presenta secuencias peptídicas con una afinidad teórica alta. Las secuencias presentadas en tejidos provienen del medio extracelular y se relacionando con proteínas inflamatorias. Las secuencias presentadas en CDs de donante sano en su mayoría provienen de membrana plasmática y se relacionan con proteínas del procesamiento y presentación antigénica.

This study involves the peptidome associated to HLA-DR molecule, in synovial tissue from Rheumatoid Arthritis (RA) patients and dendritic cells (DC) from healthy donors positive for shared epitope (SE) alleles pulsed with synovial fluid from RA patients. These alleles have been extensively studied, finding an association with RA. We using _-mass spectrometric-_ peptide repertoire describe some alleles of EC, obtained from tissue and CDs from healthy donors pulsed with FS. Based on the type of binding of these peptide sequences and their origin, we see own of these alleles, they exhibited one more akin to theoretical peptide sequences binding characteristics. This will enable us in the near future the development of a search for new potential autoantigens for this disease. Methodology: 3 RA patients selected for joint replacement surgery were recruited, genotyped for HLA-DR gene, and their synovial fluid and tissue were obtained. Also, healthy donors positive for SE alleles were recruited. From the 100 selected subjects, blood samples were obtained to generate DC, which were pulsed with synovial fluid from RA patients or left unpulsed. HLA-DR/peptides complexes were isolated from tissue and cells, later the peptides which were sequenced by mass spectrometry were eluted and analyzed by bioinformatics tools. Results: 1176 peptides from 227 parental proteins were obtained. Most peptides were presented in nested set and derived from proteins processed by the endocytic pathway. In the case of synovial tissue, most peptides derive from the extracellular medium, whereas in DC, 70% were derived from the plasma membrane. Most peptides presented by SE alleles DRB1*01:01 and DRB1*04:01 in synovial tissue were defined as of high and intermediate affinity for their respective HLA-DR allele. In DC, the peptides presented by the allele DRB1*01:01 had a high theoretical affinity for this allele. No citrullinated peptides were detected neither in synovial tissue nor in pulsed and non-pulsed DC. Conclusion: The peptidome associated to HLA - DR molecule of alleles SE presents peptide sequences with high theoretical affinity. The sequences presented in tissues derived from the extracellular medium and interacting with inflammatory proteins. The sequences presented in healthy donor CDs mostly come from plasma membrane proteins and are related to processing and antigen presentation.